Ga jaana†Aterese ya ga jaana: OX11 0DE, UK, Kago ya Teemane, Phaka ya Saense le Boitshimololedi ya Harwell, Dietcote, Oxfordshire, UK, Motswedi wa Lesedi la Teemane Co., Ltd., Setheo sa Ditshwantsho tsa Ditshedi tsa Eleketeroniki.
Setheo sa tsibogo sa go kotula lesedi se se raraaneng 1 (RC-LH1) ke karolo ya konokono ya photosynthesis ya dibakateria tse di phepole tse di jang lesedi. Re tlhagisitse dibopego tse pedi tsa maekerosekopo ya eleketeroniki ya cryo-LH1 go tswa mo Rhodopseudomonas palustris. The 2.65-Å qeto sebopeho sa RC-LH114-W rarahaneng e na le 14 subunit LH1 loops pota-potileng RC, e leng e sitisoa ke protheine W, ha a ntse a rarahaneng ntle protheine-W ke ka ho feletseng RC sebopeho pota-potiloeng ke RC. E tswetswe 16 yunitipotlana LH1 lupu. Papiso ya dibopeho tsena e fana ka kutlwisiso ya matla a quinone ka RC-LH1 rarahaneng, ho kenyeletswa le diphetoho tsa conformational tse neng di sa hlwauwa pele ha ho tlangwa quinone sebakeng sa RC QB, hammoho le sebaka sa dibaka tse thusang tsa ho tlama quinone, tse thusang ho di fetisetsa ho RC. Sebopego se se kgethegileng sa poroteine ​​ya W se thibela go tswalwa ga loop ya LH1, ka jalo se dira kanale ya go potlakisa phapanyetsano ya quinone/quinolone.
Maatla a a tlamelwang ke photosynthesis a kgona go tshegetsa mo e ka nnang ditshedi tsotlhe mo lefatsheng, mme a na le bokgoni jo bogolo jwa thekenoloji ya ditshedi e e dirisiwang ka letsatsi. Fa di ntse di rotloetsa photosynthesis ya lefatshe lotlhe, dibakateria tse di phepole tsa phototrophic le tsone di bontsha mekgwa e e farologaneng ya maatla le bokgoni jwa metaboliki. Di ka tila photosynthesis mme tsa gola jaaka dibakateria tse di jang dijo tse di farologaneng mo lefifing, di kgona go baakanya naeterojene le khabonetaeokosaete, tsa ntsha haeterojene le go senya metswako e e monkomonate (1-3). Gore lesedi le kgone go nna le maatla a dithulaganyo tseno, le tshwanetse go fetolwa ka bonako le ka tsela e e nang le matswela go nna maatla a dikhemikale. Thulaganyo eno e simolola fa setlhopha sa antenna se se tshwarang lesedi se monya lesedi mme se fetisetsa maatla a a tshwerweng kwa lefelong la tsibogo (RC), ka jalo se simolola go kgaogana ga ditšhatšhe (4 – 7). Yuniti ya motheo ya photosynthesis mo dibakethering tse di phepole tse di jang lesedi e bopilwe ka mofuta wa 2 RC, e e dikologilweng ke setlhopha sa thobo ya lesedi 1 (LH1), se se bopang setlhopha sa konokono sa RC-LH1. LH1 e bopilwe ke thulaganyo ya di-heterodimer tsa αβ tse di kobegileng, tse nngwe le nngwe ya tsone e bofang dimolekhule tse pedi tsa tlelorofili ya dibakateria (BChl) le carotenoid e le nngwe kgotsa di le pedi (8-12). Antenna e e bonolo thata ya LH1 e na le di-heterodimer di le 16 kgotsa di le 17 tsa αβ tse di dikologileng RC (9-13) mo lupung e e tswetsweng, mme mo di-complex tse dingwe tsa konokono, dipeptide tse di fetang mo leraleng di kgoreletsa go tswelela ga LH1 e e dikologileng , Ka jalo di rotloetsa go anama ga quinol/quinone le bRC1. 13-15). Semela se se phepole se se jang lesedi Rhodopseudomonas (Rps.) ke setshedi sa sekao se se kgonang go tlhaloganya phetiso ya maatla le dieleketerone e e tshegetsang go dira dijo tsa lesedi. Sebopeho sa pele sa kristale sa Rps. Mofuta wa motswako wa palustris RC-LH1 ke RC, e e dikologilweng ke dithapo di le 15 tsa LH1 tse di sa tshwaneng, tse di kgaosediwang ke poroteine ​​e e sa itsiweng e e bidiwang “Poroteine ​​W” (14). Poroteine-W e ne ya supiwa morago ga moo e le RPA4402, e leng poroteine ​​e e sa tlhaolwang ya 10.5kDa e e nang le di-helix tse tharo tse di bonelwang pele tsa go feta mo leraleng (TMH) (16). Re tshitshinya go fetola leina la dijini tsa rpa4402 tse di tsenyang khoutu ya poroteine ​​W go nna pufW gore le tsamaisane le leina le le dirisediwang dijini tse di tsenyang khoutu tsa diyunitipotlana tsa RC-L, M (pufL, pufM) le LH1α, β (pufA, pufB). Se se kgatlhang ke gore, poroteine-W e teng fela mo go bokana ka 10% ya RC-LH1, e senola Rps. palustris e ntsha di-RC-LH1 tse pedi tse di farologaneng. Mona, re tlaleha dibopeho tsa cryo-EM (cryo-EM) tsa qeto e phahameng tsa dikarolo tse pedi tsa mantlha, e nngwe e nang le protheine W le di-heterodimer tse 14 tsa αβ, e nngwe e se na protheine W le lupu e kwetsweng ya 16 Heterodimer LH1. Sebopeho sa rona se emela phetoho ya kgato kutlwisisong ya RC-LH1 rarahaneng ya Rps. palustris, ka gonne re sekasekile palo e e tshwanang ya mofuta mongwe le mongwe mme re na le tshwetso e e lekaneng go abela ka tlhamalalo peptide nngwe le nngwe le dipigmente tse di bofilweng le dilipidi le di-quinone tse di amanang le tsone. Papiso ya dibopeho tsena e bontsha hore diprotheine tse tharo tsa TMH-W tse eso fumanwe sebopehong sefe kapa sefe se seng sa RC-LH1 ho fihlela jwale di hlahisa kanale ya quinone ho potlakisa phapanyetsano ya quinone/quinolone. Palo ya mafelo a a bolokilweng a go tlama mafura le quinone a supilwe, mme re senotse phetogo e ntšhwa ya sebopego morago ga go kopanngwa ga quinone le RC, e e ka nnang ya tshwanela photosystem II (PSII) RC ya ditshedi tse di nang le okosejene tse di jang letsatsi. Diphitlhelelo tsa rona di tlamela ka dintlha tse dišwa ka ga go tsamaya ga go bofa le go ananya ga quinone/quinolone mo setlhopheng sa konokono sa RC-LH1 sa dibakateria tse di phepole tse di jang lesedi.
Gore go tlhofofadiwe thuto e e tseneletseng ya dikago tse pedi tse di fitlhelwang mo Rps. palustris, re kgaoganya RC-LH1 nngwe le nngwe ka mekgwa ya baeyokhemikhale. Mofuta o o tlhaelang wa poroteine ​​W (o morago ga fano o bidiwang ΔpufW) o ne wa phepafadiwa go tswa mo mofuteng o o tlhaelang jini ya pufW (16), mme go ka tlhagisiwa motswako o le mongwe fela wa RC-LH1. Motswako o o nang le poroteine ​​W o tlhagisiwa ke mofuta mongwe. Poroteine ​​W ya mofuta ono e fetolwa ka theke ya 10x His kwa C-terminus ya yone, gore motswako o o nang le poroteine ​​W o kgone go kopanngwa ka katlego le poroteine ​​W e e tlhaelang thata ka go dira gore tshipi e se ka ya tsamaya. Motswako ono o kgaogantswe ka katlego (16) Chromatokerafi ya Botsalano (IMAC).
Jaaka go bontshitswe mo Setshwantshong 1, dikago tseno ka bobedi di na le diyunitipotlana di le tharo tsa RC (RC-L, RC-M le RC-H) tse di dikologilweng ke antenna ya LH1. Sebopeho sa 2.80-A sa motswako o hlokang protheine-W se bontsha di-heterodimers tse 16 tsa αβ, tse bopang lupu e kwetsweng ya LH1 e potapotileng RC ka ho phethahetseng, eo e tla bitswa motswako wa RC-LH116. Sebopego sa 2.65Å sa motswako o o nang le poroteine-W se na le LH1 ya heterodimer e le 14 e e kgaoganngwang ke poroteine-W, e morago ga fano e tla bidiwang RC-LH114-W.
(A le B) Boemedi jwa boalogodimo jwa motswako. (C le D) Dipigmente tse di kopantsweng tse di tlhagisiwang ka dithupa. (E le F) Di-complex tse di lemogilweng go tswa mo godimo ga cytoplasmic di na le di-peptide le di-subunit tsa LH1 tse di emetsweng mo dikhathuneng, mme di na le dinomoro ka fa letlhakoreng la tshupanako go tswa mo phatlheng ya poroteine-W [e e tsamaelanang le dinomoro tsa Rba. di-sphaeroide tse di raraaneng (13)]. Bakeng sa LH1-α, mmala wa subunit ya protheine o mosehla; bakeng sa LH1-β, mmala wa subunit ya protheine o putswa; mo poroteineng-W, poroteine ​​e khibidu; mo go RC-H, ke cyan; mo go RC-L, ke Mmala wa Lamunu; bakeng sa RC-M, mmala o moputswa. Di-cofactor di emetswe ke dithupa, botala bo emela dimolekhule tsa BChl le BPh a, bophepole bo emela di-carotenoid, mme bosehla bo emela dimolekhule tsa UQ10. (G le H) Pono e e godisitsweng ya phatlha ya poroteine-W mo kgaolong e e lekanang ya RC-LH114-W e e raraaneng (G) le e e raraaneng ya RC-LH116 (H). Di-cofactor di bontshitswe ka mokgwa wa ho tlatsa sebaka, chelated quinone e bontshitswe ka boputswa. Sekgala sa poroteine-W se tlhomolotswe ke mola o motala o o thaladitsweng mo go (G), mme dikhuti tse dinnye tse quinone/quinolol e phatlalalang mo go tsone mo lesaleng la LH116 di tlhomolotswe ke mola o montsho o o thaladitsweng mo go (H).
Setshwantsho sa 1 (A le B) se bontsha RC e e dikologilweng ke ditlhopha tse di bulegileng kgotsa tse di tswetsweng tsa di-heterodimer tsa LH1αβ, tse nngwe le nngwe ya tsone e bofang BChl tse pedi le carotenoid e le nngwe (Setshwantsho 1, C le D). Dithuto tse di fetileng di bontshitse gore Rps ke LH1 complex. Mo tseleng ya go dira ditshedi ya spirulina xanthin, mefuta eno e na le dipalopalo tse di tlhakaneng tsa di-carotenoid (17). Le fa go ntse jalo, spiropyrroxanthin ke carotenoid e e laolang mme kitlano ya yona e a kgotsofatsa. Ka jalo, re ne ra tlhopha go dira sekao sa spiroxanthin mo mafelong otlhe a a tlamang LH1. Di-polypeptide tsa alpha le beta ke di-TMH tse di nang le dikgaolo tsa kwa ntle tsa lera le lekhutshwane (Setshwantsho 1, A, B, E, le F). Le fa kitlano ya masalela a le 17 kwa C-terminus e ne e sa lemogiwe, polypeptide ya alpha e ne ya kgaoganngwa go tswa go Met1 go ya go Ala46 mo dikopong tseno ka bobedi. β polypeptide e ne ya fokodiwa go tswa go Gly4 go ya go Tyr52 mo RC-LH116, le go tswa go Ser5 go ya go Tyr52 mo RC-LH114-W. Ga go na kitlano ya masalela a 3 kgotsa 4 a N-terminal kgotsa a le 13 a C-terminal a a lemogilweng (Setshwantsho S1). Tshekatsheko ya spectrometry ya bontsi jwa motswako o o tlhakaneng wa RC-LH1 o o baakantsweng go tswa mo mofuteng wa mofuta wa naga e bontshitse gore kgaolo e e tlhaelang e ne e le ditlamorago tsa go kgaoga ga dipeptide tseno ka tsela e e sa tshwaneng (Setshwantsho S1 le S2). Formylation ya N-theminale ya α-Met1 le yona e ne ya lemogiwa (f). Tshekatsheko e bontshitse gore α-peptide e na le masalela a fMet1 go ya go Asp42/Ala46/Ala47/Ala50, mme β-peptide e na le masalela Ser2 go ya go Ala53, e e dumalanang sentle le mmapa wa kitlano ya EM ya mogote o o kwa tlase.
Go dirisana ga α-His29 le β-His36 go dira gore di-BChl di lebane difatlhego; heterodimer nngwe le nngwe ya αβ e kopana le baagelani ba yone go bopa lupu e e bulegileng (RC-LH114-W) kgotsa lupu e e tswetsweng (RC-LH116) go dikologa RC Thulaganyo ya mmala o o kopantsweng wa exciton (Setshwantsho 1, C le D). Fa go bapisiwa le setlhopha sa 877 nm sa RC-LH114-W, phetogo e khibidu ya go monya ga 880 nm ya RC-LH116 ke 3 nm (Setshwantsho 2A). Le fa go ntse jalo, sebopego sa dichroism se se sediko se batlile se tshwana (Setshwantsho 2B), se se supang gore le fa go na le pharologano e e bonalang sentle fa gare ga di-loop tse di bulegileng le tse di tswetsweng, tikologo ya selegae ya di-BChls e tshwana thata. Go fetoga ga bohibidu jwa go monya go ka tswa go bakilwe ke go fokotsega ga motsamao wa mogote le go tlhomama go go oketsegileng mo lupung e e tswetsweng (18, 19), phetogo ya go kopana ga pigment e e bakiwang ke lupu e e tswetsweng (20, 21), kgotsa go kopana ga ditlamorago tseno tse pedi (11).
(A) Sebopego sa go monya sa ultraviolet/se se bonalang/se se gaufi le infrared, se ditlhora tsa sone di tshwailweng ka dipigmente tsa tsone tse di tsamaelanang mme di tlwaelegile go nna tlhora ya BPh kwa 775 nm. (B) Sebopeho sa dichroism se sediko se tlwaelehileng ho BChl monya ka 805 nm. (C le D) Kgethilweng ΔA mebalabala ho tloha nako-rarolloa monya mebalabala ya RC-LH114-W rarahaneng (C) le RC-LH116 rarahaneng (D). Go bapisiwa botoka, di-spectra tsotlhe di tlwaelesega go nna ∆A ya −A ka 0.2 ps. (E) Seelo sa oksijene ya cytochrome c2 morago ga go tsenngwa ga marang fa go na le ditlhokego tse di farologaneng tsa UQ2 (bona Setshwantsho S8 go bona tshedimosetso e e tala). (F) Mo diseleng tse di godisitsweng ka fa tlase ga lesedi le le kwa tlase, le le magareng kgotsa le le maatla a a kwa godimo (10, 30 kgotsa 300μMm-2 s-1, ka go latelana), diyunitipotlana tsa poroteine ​​W le RC-L mo sebopegong se se itshekisitsweng le selekanyo sa lera le le kgaoganeng. Tlhomamisa selekanyo sa poroteine ​​ka go dirisa motlakase wa gel ya SDS-polyacrylamide le go tlhatlhoba masole a mmele (bona Setshwantsho S9 go bona tshedimosetso e e tala). Tlhomamisa karolelano mabapi le RC-LH114-W rarahaneng e hlwekisitsweng. Tekanyo ya setoikiometri ya RC-L go poroteine-W ya motswako ke 1:1.
Di-BChl tse di mo maemong a 1 mo lupung e e sa siamang ya αβ14 ya RC-LH114-W (Setshwantsho 1, A, C, le E) di gaufi le moneeladitirelo wa konokono wa RC (P) ka 6.8Å go feta di-BChl tse di lekanang mo RC-LH116 (Setshwantsho. 1, B, D); le fa go ntse jalo, kinetics ya monyelo ya nakwana ya di-complex tse pedi e bontsha gore mo RC-LH114-W le RC-LH116, diphetogo tsa nako ya phetiso ya maatla a go tsosa go tswa go LH1 go ya go RC ke 40 ± 4 le 44 ± 3 ps (Setshwantsho 2). , C le D, Setshwantsho S4 le Lenaneo S2). Gape ga go na pharologano e e bonalang mo phetisong ya eleketeroniki mo teng ga RC (Setshwantsho S5 le sekwalwa sa tlaleletso se se amanang le sona). Re belaela gore go tsamaisana go go gaufi ga nako ya phetiso ya maatla magareng ga LH1 le RC-P go bakilwe ke sekgala se se tshwanang, angle le maatla a a ka nnang teng a bontsi jwa BChl mo dithapong tse pedi tsa LH1. Go lebega go sekaseka mokgwa wa maatla a LH1 go fitlhelela sekgala se se kwa tlase ga go bonako go feta phetiso ya maatla ka tlhamalalo go tswa kwa mafelong a a sa siamang go ya kwa RC. Loop ya LH1 e e bulegileng mo RC-LH114-W e ka nna ya nna le motsamao o o sa reng sepe wa mogote mo maemong a themperetšha e e kwa tlase go sekaseka popego, mme go na le popego ya lesale le le telele la αβ14 mo themphereitšheng ya phaposi go tswa mo sekgaleng sa mmala wa βBChls mo boemong jwa RC 1.
Motswako wa RC-LH116 o na le di-BChl di le 32 le di-carotenoid di le 16, mme thulaganyo ya one ka kakaretso e tshwana le e e bonweng go tswa mo pidpidum ya Thermochromatium (Tch.) (12) le algae e tala (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10). Morago ga go tlhamalatsa, go ne ga lemogiwa fela diphapogo tse dinnye mo maemong a αβ heterodimers, bogolo jang 1-5, 15, le 16 (Setshwantsho S6). Go nna teng ga poroteine-W go na le tshusumetso e kgolo mo sebopegong sa LH1. Di-TMH tsa yona tse tharo di kopantswe ke di-loop tse kgutshwane, ka N-terminal ka lehlakoreng la lumen la motswako le C-terminal ka lehlakoreng la cytoplasmic (Ditshwantsho 1A le 3, A ho isa ho D). Poroteine-W e tshaba metsi thata (Setshwantsho 3B), mme TMH2 le TMH3 di dirisana le LH1αβ-14 go bopa boalogodimo jwa transmembrane (Setshwantsho 3, B le E go ya go G). Segokanyimmediamentsi sa sebolokigolo e bopilwe thata ka masalela a Phe, Leu le Val mo kgaolong ya transmembrane. Masalela ano a kgobokantswe ka diaminoesiti tse di tshabang metsi le dipigmente tsa αβ-14. Masalela mangwe a polara le one a na le seabe mo tirisanong, go akaretsa le kgolagano ya haeterojene magareng ga W-Thr68 le β-Trp42 mo godimo ga leroba le le raraaneng (Setshwantsho 3, F le G). Mo godimo ga cytoplasm, Gln34 e bapile le setlhopha sa keto sa di-carotenoid tsa αβ-14. Mo godimo ga moo, molekhule wa n-dodecyl β-d-maltoside (β-DDM) o ne wa rarabololwa, mme mogatla wa one o o tshabang metsi o ne wa atologela kwa segokaganong se se fa gare ga poroteine-W le αβ-14, mme mogatla wa mafura o ka tswa o le mo mmeleng. Re lemogile gape gore dikgaolo tsa tharabololo ya C-terminal tsa poroteine ​​W le RCH di gaufi thata, mme e seng mo selekanyong sa go bopa ditirisano tse di rileng (Setshwantsho 1, A le E). Le fa go ntse jalo, go ka nna le ditirisano mo diaminoesiti tsa C-terminal tse di sa rarabololwang tsa diporoteine ​​tseno tse pedi, tse di ka nnang tsa tlamela ka mokgwa wa go thapa poroteine-W ka nako ya go kopanya RC-LH114-W complex.
(A) Protein-W, e e lebaneng le segokaganyi le LH1αβ14 ka sebopego sa dipopae, e na le ketane ya letlhakore e e bopegileng jaaka thobane (e khibidu), e e bontshiwang mo karolong ya setshwantsho sa bokgoni jwa electrostatic (boalo jo bo pududu jo bo bonaletsang jo bo nang le maemo a konturu a 0.13). (B) Poroteine-W e e emetsweng ke boalo jo bo mmala jo bo tshabang metsi. Mafelo a polara le a a laisitsweng a bontshiwa ka mmala wa cyan, mafelo a a tshabang metsi a bontshiwa ka bosweu, mme mafelo a a tshabang metsi thata a bontshiwa ka mmala wa lamune. (C le D) Poroteine-W e e emetsweng mo dipopaeng, tlwaelo ya yone e tshwana le e e mo go (A) (C), mme e dikolositswe ka 180° (D). Ho ya ka boemo tatelanong, masalla a khethollang a amohela sekema sa mmala wa molalatladi, moo N-terminal e leng putswa mme C-terminal e le khubelu. (E) Poroteine-W ka pono e e tshwanang le e e mo go (A), mme masalela a a kwa segokaganong sa poroteine-W:LH1 a emetswe ke dithupana tse di nang le matshwao a a gokeletsweng. (F) Protein-W e dikolosiwa 90 ° mabapi le (E) le LH1αβ14 mo boemedi jwa dipopae, le mabapi le masalela a segokaganyi mo boemedi jwa bara. Masalela a a lepeletseng go tswa mo polypeptide ya beta a tshwailwe. Cofactor e bontshiwa jaaka bara e e tsamaelanang le mmala wa Setshwantsho 1, β-DDM e e bodileng e bontshiwa ka botala jwa loapi, mme okosejene e bontshiwa ka bohibidu. (G) Pono e e mo go (F) e dikolosiwa ka 180°, ka masalela a a tlhageletseng a polypeptide ya alpha e e tshwailweng.
Poroteine-W e tsaya sebaka sa heterodimer ya αβ (ya bo 15 mo Setshwantshong 1F), ka jalo e thibela go tswalwa ga loop le go sekamisa di-heterodimer tsa ntlha tse tharo tsa αβ. Go ne ga lemogiwa gore angle e e kwa godimo ya go sekama ga heterodimer ya ntlha ya αβ-1 fa e bapisiwa le filimi e e tlwaelegileng e ne e le 25° go ya go 29° (Setshwantsho 1, A le E), e e neng ya bopiwa ke go sekama ga 2° go ya go 8° ga αβ-1 mo RC A phapang e e bogale-LH116 leF (Setshwantsho 1, B). Di-heterodimer tsa bobedi le tsa boraro di sekametse ka 12° go ya go 22° le 5° go ya go 10°, ka go latelana. Ka ntlha ya kgoreletso ya steric ya RC, go sekama ga αβ-1 ga go akaretse para ya bobedi ya αβ (e e tsamaelanang le αβ ya bo 16 mo ​​Setshwantshong 1F), ka jalo go bopa phatlha e e bonalang sentle mo mosakong wa LH1 (Setshwantsho 1, A le E) . Ka ntlha ya go tlhoka di-heterodimer tse pedi tsa αβ, tse di tsamayang le go latlhegelwa ke di-BChl di le nne le di-carotenoid di le pedi, ga go na epe ya di-carotenoid e e golaganang le yunitipotlana ya αβ-1 e e sothegileng, mme seno se felela ka lesale la LH114-W le le nang le di-carotenoid di le 13 tsa Merogo le di-BChl di le 28. Diphopholetso tsa tharabololo ya selegae ya dikarolo tse pedi tse di raraaneng mo dikgaolong tsa αβ1 go ya go 7 di kwa tlase ga tsa lupu yotlhe ya LH1, e e ka bontshang bopolasetiki jo bo tlholegileng jwa yunitipotlana ya LH1 e e bapileng le lefelo la RC QB (Setshwantsho 4) .
Ditshwantsho tsa RC-LH114-W (A le B) le RC-LH116 (C le D) di bontshitswe go tswa mo ponong e e tshwanang e e kwa godimo/pono e e kwa thoko (A le B) (A le C) le boalogodimo jwa leroba jwa Fig. 1. (B le D). Dinotlolo tse di mmala di bontshitswe ka fa mojeng.
Motswako o mongwe fela o o nang le dipharologantsho tsa konokono o o nang le selekanyo sa 1:14 ke dimer ya Rhodococcus sphaeroides (Rba.) RC-LH1-PufX (13). Le fa go ntse jalo, poroteine ​​W le PufX ga di na homology e e bonalang, mme di na le tshusumetso e kgolo mo dibopegong tsa tsona tsa LH1 ka go farologana. PufX ke TMH e le nngwe e e nang le karolo ya cytoplasmic ya N-terminal e e dirisanang le letlhakore la cytoplasmic la yunitipotlana ya RC-H (13) mo boemong jo bo tsamaelanang le Rps. LH116αβ-16. PufX e tlhama kanale ya phapanyetsano ya quinone/quinolone magareng ga RC-LH1 le motswako wa cytochrome bcl mme e teng mo Rba yotlhe. sphaeroides konokono rarahaneng (13). Le fa segokaganyi sa monomere-monomere se le mo Rba. Dimer ya sphaeroides RC-LH1-PufX e mo boemong jo bo tlamang jwa poroteine ​​W mo RC-LH114-W, mme sekgala se se tlhotlhelediwang ke PufX le poroteine-W se mo boemong jo bo lekanang (Setshwantsho S7A). Sekgala se se mo RC-LH114-W gape se tsamaisana le kanale ya quinone e e akanyediwang (8) ya Pseudomonas rosea LH1, e e bopilweng ke dipeptide tse di sa amaneng le poroteine ​​W kgotsa PufX (Setshwantsho S7B). Mo godimo ga moo, kanale ya quinone mo Blc. LH1 e tala ya emerald e e bopilweng ka go se akaretse subunit e le nngwe ya γ (7) e mo boemong jo bo tshwanang (Setshwantsho S7C). Le fa e tseregangwa ke diporoteine ​​tse di farologaneng, go bonala ga ditšhanele tseno tsa quinone/quinolol mo boemong jo bo tshwanang mo RC-LH1 complex go lebega e le sekai sa thutotlhagelelo e e kopaneng, e e supang gore phatlha e e tlhodilweng ke poroteine ​​W e ka dira jaaka kanale ya quinone.
Sekgala se se mo lupung ya LH114-W se letla go bopiwa ga kgaolo ya lera e e tswelelang fa gare ga sebaka sa ka fa gare sa RC-LH114-W complex le lera le lentsi (Setshwantsho 1G), go na le go golaganya dikarolo tse pedi ka pore ya poroteine ​​jaaka mo diporoteineng. Motswako wa RC-LH116 o tshwana le Tch e e tswetsweng. Motswako o o tshwanang le nale (22) (Setshwantsho 1H). Ka ge go anama ga quinone ka lera go le bonako go feta go anama ka kanale e tshesane ya poroteine, loop e e bulegileng ya LH114-W e ka letla thekiso e e bonako ya RC go feta loop e e tswetsweng ya LH116, mme go anama ga quinone mo RC go ka nna ga thibelwa thata. Gore re kgone go leka gore a poroteine ​​W e ama phetogo ya di-quinone ka RC, re ne ra dira teko ya oksijene ya cytochrome mo selekanyong se se rileng sa ubiquinone 2 (UQ2) (analogue ya UQ10 ya tlholego e e nang le mogatla o mokhutshwane wa isoprene) (Setshwantsho 2E). Le fa go nna teng ga quinone e e nang le chelated go kgoreletsa go tlhomamisa ka nepo ga tlhomamo e e bonalang ya Michaelis (RC-LH114-W le RC-LH116 di siametse 0.2±0.1μM le 0.5±0.2μM, ka go latelana), selekanyo se se kwa godimo sa RC-LH2.4-6-1. ± 5% e kgolo go feta RC-LH116 (3,6 ± 0,1 e-RC-1 s-1).
Re ne ra fopholetsa kwa tshimologong gore poroteine-W e teng mo go ka nnang 10% ya motswako wa konokono (16); mona, dikelo tsa ho dula tsa disele tsa kgolo ya lesedi le tlase, lesedi le mahareng, le lesedi le phahameng ke 15±0.6%, 11±1% le 0.9±0.5, ka ho latellana % (Setshwantsho 2F). Papiso ya bontsi ya spectrometry ya bokete e bontshitse gore go okediwa ga theke ya histidine ga go a fokotsa bontsi jo bo amanang jwa poroteine-W fa e bapisiwa le mefuta ya mofuta wa naga (P = 0.59), ka jalo maemo ano ga se sediriswa sa poroteine-W e e fetotsweng (Setshwantsho S10). Le fa go ntse jalo, go nna gono go go kwa tlase ga poroteine-W mo setlhopheng sa RC-LH1 go ka nna ga dira gore di-RC dingwe di fetoge ka lobelo lo lo potlakileng, ka jalo go fokotse phapanyetsano e e bonya ya quinone/quinolone mo setlhopheng sa RC-LH116. Re lemogile gore seelo se se kwa godimo sa go nna mo leseding ga se tsamaisane le tshedimosetso ya bosheng ya transcriptomics, e e supang gore go tlhagisiwa ga dijini tsa pufW go a oketsega ka fa tlase ga lesedi le le maatla (Setshwantsho S11) (23). Pharologano magareng ga go kwalololwa ga pufW le go tsenngwa ga poroteine-W mo setlhopheng sa RC-LH1 e a tlhakanya tlhogo mme e ka bontsha taolo e e raraaneng ya poroteine.
Mo RC-LH114-W, go abelwa dimolekhule tsa β-DDM di le 6 tsa di-cardiolipin (CDL) di le 6, di-POPC di le 7, di-POPG di le 1 le di-β-DDM di le 29 le go tshwantshiwa mo go yone di-CDL di le 6, di-POPC di le 24, di-POPG di le 2 le di-POPG di le 12. RC-LH116 (Setshwantsho 5, A le B). Mo dipopegong tse pedi tse, CDL e batla e le mo letlhakoreng la cytoplasmic la motswako, fa POPC, POPG le β-DDM tsone di le mo letlhakoreng la luminal thata. Dimolekhule tse pedi tsa mafura le sesepa di ne tsa kgaoganngwa mo kgaolong ya αβ-1 go ya go αβ-6 ya motswako wa RC-LH114-W (Setshwantsho 5A), mme di le tlhano di ne tsa kgaoganngwa mo kgaolong e e lekanang ya RC-LH116 (Setshwantsho 5B ). Di-lipid tse dintsi di ne tsa fitlhelwa ka fa letlhakoreng le lengwe la motswako, bogolo jang CDL, e e neng e kokoantswe fa gare ga RC le αβ-7 go ya go αβ-13 (Setshwantsho 5, A le B). Di-lipid tse dingwe tse di rarabolotsweng ka popego le ditlhatswa di kwa ntle ga lesale la LH1, mme diketane tsa acyl tse di rarabolotsweng sentle di atologela fa gare ga diyunitipotlana tsa LH1, tse di tlhomilweng ka nakwana jaaka β-DDM mo RC-LH114-W, mme di tlhalosiwa jaaka β-DDM mo RC A motswako wa βPOPC-DHDM le16. Maemo a a tshwanang a dilipidi tsa chelating le ditlhatswa mo sebopegong sa rona a supa gore ke mafelo a a maleba a go tlama a fisioloji (Setshwantsho S12A). Maemo a dimolekhule tse di lekanang mo Tch le one a na le go tlhomama go go siameng. Bonolo le Trv. Mofuta wa 970 RC-LH1s (Setshwantsho S12, B go ya go E) (9, 12) le masalela a a kopanyang haeterojene a setlhopha sa tlhogo ya mafura a bontshitse tshomarelo e e siameng mo go tlhamalatseng tatelano (Setshwantsho S13), se se supang gore CDL e e bolokilweng e e tlamang RC (24), mafelo ano a a bolokilweng mo compCHLx1.
(A le B) Dipeptide tsa RC-LH114-W (A) le RC-LH116 (B) di emetswe ke dikhathune, mme dipigmente di emetswe ke dithupana, ho sebediswa sekema sa mmala se Setshwantshong 1. Dilipidi di bontshitswe ka bohibidu, mme ditlhatswa di bontshitswe ka boputswa. UQ e e bofilweng mo mafelong a RC QA le QB e bosetlha, fa UQ e e kgaoganeng e le pududu. (C le D) Dipono tse di tshwanang le tsa (A) le (B), go tlogetswe di-lipid. (E go ya go G) Pono e e godisitsweng ya Q1(E), Q2(F) le Q3(G) go tswa mo RC-LH116, ka diketane tsa matlhakore tse di tlhotlheletsang. Ditlamo tsa haeterojene di bontshiwa e le mela e mentsho e e thaladitsweng.
Mo RC-LH116, bobedi RC QA le QB UQ, tse di tsayang karolo mo phetisong ya dieleketerone mo thulaganyong ya go kgaoganya tefiso, di bola mo mafelong a tsone a go tlama. Le fa go ntse jalo, mo RC-LH114-W, QB quinone ga e ise e rarabololwe mme go tla tlotliwa ka botlalo fa tlase fano. Mo godimo ga di-quinone tsa QA le QB, dimolekhule tse pedi tsa UQ tse di nang le chelated (tse di leng fa gare ga di-ring tsa RC le LH1) di abetswe mo sebopegong sa RC-LH114-W go ya ka ditlhopha tsa tsone tsa tlhogo tse di rarabolotsweng sentle (tse di leng mo Q1 le Q2, ka go latelana). sebaka). Setshwantsho 5C). Diyuniti tse pedi tsa isoprene di abetswe Q1, mme mmapa wa kitlano o rarolla mehatla e feletseng ya isoprene e 10 ya Q2. Mo sebopegong sa RC-LH116, dimolekhule tse tharo tsa UQ10 tse di nang le chelated (Q1 go ya go Q3, Setshwantsho 5D) di ne tsa rarabololwa, mme dimolekhule tsotlhe di na le kitlano e e tlhapileng go ralala mogatla (Setshwantsho 5, D go ya go G). Mo dibopegong tse pedi, maemo a ditlhopha tsa tlhogo ya quinone tsa Q1 le Q2 a na le go tlhomama go go gaisang (Setshwantsho S12F), mme a dirisana fela le RC. Q1 e mo kgorong ya phatlha ya W ya RC-LH114-W (Setshwantsho 1G le 5, C, D le E), mme Q2 e gaufi le lefelo la go tlama la QB (Setshwantsho 5, C, D) le F). Masalela a L-Trp143 le L-Trp269 a a bolokilweng a gaufi thata le Q1 le Q2 mme a tlamela ka ditirisano tse di ka nnang teng tsa π-stacking (Setshwantsho 5, E le F, le Setshwantsho S12). L-Gln88, 3.0 Å go tswa mo okosejeneng e e kgakala ya Q1, e tlamela ka kgolagano e e nonofileng ya haeterojene (Setshwantsho 5E); masalela ano a bolokilwe mo di-RC tsotlhe kwa ntle ga kamano e e kgakala thata (Setshwantsho S13). L-Ser91 e emiseditswe ka Thr ka tsela e e sa fetogeng mo di-RC tse dingwe tse dintsi (Setshwantsho S13), ke 3.8 Angstroms go tswa mo okosejeneng ya methyl ya Q1, mme e ka tlamela ka ditlamo tse di bokoa tsa haeterojene (Setshwantsho 5E). Q3 ga e lebege e na le tirisano e e rileng, mme e mo kgaolong e e tshabang metsi fa gare ga yunitipotlana ya RC-M le yunitipotlana ya LH1-α 5 go ya go 6 (Setshwantsho 5, D le G). Q1, Q2 le Q3 kgotsa di-quinone tse di gaufi tse di nang le chelated le tsone di rarabolotswe mo Tch. Bonolo, Trv. Mofuta wa 970 le Blc. Sebopeho sa iris (9, 10, 12) se supa sebaka sa ho tlama sa quinone se thusang se bolokilweng sebopehong sa RC-LH1 (Setshwantsho S12G). Di-UQ tse tlhano tse di bodileng mo RC-LH116 di dumalana sentle le 5.8±0.7 ya UQ nngwe le nngwe e e raraaneng e e laolwang ke chromatography ya seedi e e dirang sentle thata (HPLC), fa di-UQ tse tharo tse di bodileng mo RC-LH114-W di le kwa tlase ga Boleng jo bo lekanyeditsweng jwa 6.2±0.3 bo bontsha gore S1 popego.
Dipolypeptide tsa L le M tse di tshwanang tsa maaka nngwe le nngwe ya tsone e na le di-TMH di le tlhano mme di bopa heterodimer e e kopanyang dimer e le nngwe ya BChl, dimonomere tse pedi tsa BChl, dimonomere tse pedi tsa bacteriophage (BPh), le tshipi e le nngwe e e seng ya Heme le molekhule o le mongwe kgotsa di le pedi tsa UQ10. Ka go nna teng ga ditlamo tsa haeterojene mo setlhopheng sa ketone se se felelang le go kokoanngwa ga yona go go itsegeng mo Rps, di-carotenoid di tsenngwa mo yuniting e nnye ya M, e e bidiwang cis-3,4-dehydroorhodopin. Mefuta (25). Domain ya lera la ka ntle la RC-H e anchored ho lera ke TMH e le nngwe. Sebopeho sa RC ka kakaretso se tshwana le diyunitipotlana tse tharo tsa RC tsa mefuta e amanang (jwalo ka Rba). di-sphaeroide (ID ya PDB: 3I4D). Di-macrocycle tsa BChl le BPh, mokwatla wa carotenoid le tshipi e e seng ya heme di kopana mo teng ga selekanyo sa tharabololo ya dibopego tseno, fela jaaka setlhopha sa tlhogo sa UQ10 kwa lefelong la QA le quinone ya QB kwa RC-LH116 (Setshwantsho S15).
Go nna teng ga dibopego tse pedi tsa RC tse di nang le dikelo tse di farologaneng tsa go nna mo lefelong la QB go tlamela ka tšhono e ntšhwa ya go sekaseka diphetogo tse di tlhomameng tsa sebopego tse di tsamayang le go tlama ga QB quinone. Mo setlhopheng sa RC-LH116, quinone ya QB e mo boemong jo bo bofilweng ka botlalo jwa “bogaufi” (26), mme go kgaogana ga RC-LH114-W ga go na quinone ya QB. Ga go na QB quinone mo RC-LH114-W, se se gakgamatsang ka gonne motswako o o matlhagatlhaga, go feta motswako wa RC-LH116 o o nang le QB quinone e e rarabolotsweng ka popego. Le fa di-ring tse pedi tsa LH1 di na le di-quinone di ka nna thataro, di le tlhano di rarabolotswe ka popego mo ring e e tswetsweng ya RC-LH116, fa e le di le tharo fela tse di lekanyeditsweng ka popego mo ring e e bulegileng ya RC-LH114-W . Bothata jono jo bo oketsegileng jwa popego bo ka bontsha go emisediwa ka bonako ga mafelo a RC-LH114-W QB, go tsamaya ga quinone ka bonako mo lefelong le le raraaneng, le kgonagalo e e oketsegileng ya go kgabaganya loop ya LH1. Re tshitshinya gore go tlhoka UQ mo lefelong la RC QB la RC-LH114-W e ka tswa e le ditlamorago tsa lefelo le le raraaneng le le le matlhagatlhaga thata, mme lefelo la QB la RC-LH114-W le gatseditswe ka bonako mo thekisong ya UQ Kgato e e rileng (botseno jwa lefelo la QB le tswetswe) ref.
Ntle le QB, ho potoloha ho tsamayang le L-Phe217 ho boemo bo sa dumellaneng le ho tlama ha UQ10, hobane ho tla baka thulano ya sebaka le yuniti ya pele ya isoprene ya mohatla (Setshwantsho 6A). Mo godimo ga moo, diphetogo tse di bonalang tsa konokono tsa popego di bonala sentle, segolobogolo helix de (helix e khutshwane mo lobelong fa gare ga TMH D le E) koo L-Phe217 e sutisediwang kwa kgetsaneng e e tlamang ya QB le go dikologa ga L-Tyr223 (Setshwantsho 6A ) Go kgaola kgolagano ya haeterojene le foreimi ya binding ya QB le M-4. lefelo (Setshwantsho 6B). Helix de e dikologa kwa botlaseng jwa yone, Cα ya L-Ser209 e sutisitswe ka 0.33Å, fa L-Val221Cα yone e sutisitswe ka 3.52Å. Ga go na diphetogo tse di ka lemogiwang mo TMH D le E, tse di ka tlhomiwang mo dipopegong tseno ka bobedi (Setshwantsho 6A). Go ya ka fa re itseng ka teng, se ke popego ya ntlha mo RC ya tlholego e e tswalang lefelo la QB. Papiso le popego e e feletseng (e e bofilweng ke QB) e bontsha gore pele ga quinone e fokodiwa, go tlhokega phetogo ya sebopego go dira gore e tsene mo quinone. L-Phe217 e dikologa go bopa tirisanommogo ya π-stacking le setlhopha sa tlhogo sa quinone, mme helix e sutela kwa ntle, e letla lerapo la L-Gly222 le ketane ya letlhakore la L-Tyr223 go bopa mafaratlhatlha a kgolagano ya haeterojene a a nang le popego ya kgolagano ya haeterojene e e tlhomameng (Setshwantsho 6, A le C).
(A) Popae e e tshwaraganeng ya holokeramo (ketane ya L, ketane ya mmala wa lamune/M, magenta) le popego ya apo (botala), e mo go yone masalela a konokono a bontshiwang ka sebopego sa kemedi e e tshwanang le thobane. UQ10 e emetswe ke bara e tshehla. Mola o o marontho o bontsha ditlamo tsa haeterojene tse di bopilweng mo sebopegong sotlhe. (B le C) Boemedi ba bokahodimo ba apolipoprotein le sebopeho kaofela sa lesale, ho totobatsa oksijene ya ketane ya lehlakoreng ya L-Phe217 ka boputswa le L-Tyr223 ka bofubedu, ka ho latellana. Yunitipotlana ya L e mmala wa lamune; diyunitipotlana tsa M le H ga di na mmala. (D le E) Mafelo a RC QB a apolipoporoteine ​​(D) le a a feletseng (E) [mmala ka (A) ka go latelana] le Thermophilus thermophilus PSII (tala, pududu ka quinone ya polasetiki; ID ya PDB: 3WU2) Lepalepanya (58).
Ka go sa lebelelwa, le fa dibopego di le mmalwa tsa di-RC tse di tlhaelang QB tse di senang LH1 di le teng, diphetogo tsa popego tse di lemogilweng mo thutopatlisisong eno ga di ise di begwe mo nakong e e fetileng. Tsena di kenyeletsa sebopeho sa ho fokotseha ha QB ho tswa ho Blc. (ID ya PDB: 3PRC) (27), Tch. (28) le Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29), tse tsotlhe di batlang di tshwana le popego ya tsona ya QB ka kakaretso. Tlhatlhobo e e tseneletseng ya 3PRC e senotse gore dimolekhule tsa sesepa sa LDAO (Lauryl Dimethyl Amine Oxide) di tlama kwa kgorong ya boemo jwa QB, e leng se se ka thibelang go rulaganngwa sešwa go nna sebopego se se tswetsweng. Le fa LDAO e sa bole mo lefelong le le tshwanang mo 1EYS kgotsa 1OGV, di-RC tseno di baakanngwa ka go dirisa sesepa se se tshwanang mme ka jalo di ka ntsha phelelo e e tshwanang. Sebopeho sa kristale sa Rba. Sphaeroides RC e e dirilweng mmogo le cytochrome c2 (ID ya PDB: 1L9B) le yone e lebega e na le lefelo la QB le le tswetsweng. Le fa go ntse jalo, mo ntlheng eno, kgaolo ya N-terminal ya polypeptide ya RC-M (e e dirisanang le lefelo la go tlama la QB ka kgolagano ya H ya masalela a Tyr mo helix ya Q) e amogela sebopego se se seng sa tlholego, mme phetogo ya sebopego sa QB ga e sekasekwe go ya pele (30 ). Se se tlhomamisang ke gore ga re ise re bone mofuta ono wa go senyega ga polypeptide ya M mo sebopegong sa RC-LH114-W, se se batlang se tshwana le kgaolo ya N-terminal ya RC-LH116 RC. Gape go tshwanetse ga elwa tlhoko gore morago ga go fedisa antenna ya LH1 e e theilweng mo sesepa, di-RC tsa apolipoprotein mo PDB di ne tsa rarabololwa, e leng se se neng sa fedisa matangwana a ka fa gare a quinone le di-lipid mo phatlheng e e fa gare ga RC le boalo jo bo ka fa gare jwa lesale la LH1 le le dikologileng (31, 32). RC e nna e dira ka gonne e boloka di-cofactor tsotlhe, kwa ntle ga quinone ya QB e e bolang, e e sa tlhomamang thata mme gantsi e latlhega ka nako ya thulaganyo ya go baakanyetsa (33). Mo godimo ga moo, go itsege gore go tlosiwa ga LH1 le di-lipid tsa tlholego tsa modikologo go tswa mo RC go ka nna le tlhotlheletso mo ditirong, tse di jaaka go khutshwafatsa nako ya botshelo ya P + QB-state e e kgaogantsweng ka tšhatšhe (31, 34, 35). Ka jalo, re fopholetsa gore go nna teng ga lesale la selegae la LH1 le le dikologileng RC go ka nna ga boloka lefelo la QB le le “tswetsweng”, ka jalo go boloka tikologo ya selegae gaufi le QB.
Le fa apolipoprotein (ntle le QB quinone) le popego e e feletseng di emela fela dinepe tse pedi tsa thekiso ya lefelo la QB, go na le motseletsele wa ditiragalo, go na le ditshupo tsa gore go tlama go ka gatediwa go thibela go tlama gape ka hydroquinone Go thibela thibelo ya substrate. Tirisanommogo ya quinolol le quinone gaufi le lefelo la QB la apolipoprotein e ka nna ya farologana, e leng se se dirang gore e ganwe ke RC. Go sa le go tshitshinngwa gore diphetogo tsa popego di na le seabe mo go bofeng le go fokotsa di-quinone. Bokgoni jwa di-RC tse di gatseditsweng go fokotsa di-quinone morago ga go tlwaela lefifi bo a koafadiwa (36); X-ray crystallography e bontsha gore tshenyo eno e bakilwe ke gore di-quinone tsa QB di tshwaregile mo sebopegong se se “kgakala” se se ka nnang 4.5 Å go tswa mo boemong jo bo gaufi jo bo dirang (26) , 37). Re tshitshinya gore sebopego seno sa go tlama se se kgakala ke setshwantsho sa boemo jo bo fa gare ga apolipoprotein le popego ya lesale le le tletseng, le le latelang tirisanommogo ya ntlha le quinone le go bulwa ga lefelo la QB.
Mofuta wa II RC o o fitlhelwang mo setlhopheng sa PSII sa dibakateria tse di rileng tse di jang letsatsi le dibakateria tsa cyano, algae le dimela o na le tshomarelo ya popego le ya tiro (38). Go tlhamalatsa ga popego go go bontshitsweng mo Setshwantshong sa 6 (D le E) go gatelela go tshwana magareng ga di-RC tsa PSII le lefelo la QB la motswako wa RC ya dibakateria. Papiso ena e sa le e le mohlala wa ho ithuta dithulaganyo tse amanang haufi tsa ho tlama le ho fokotsa quinone. Dikgatiso tse di fetileng di ne tsa akantsha gore diphetogo tsa popego di tsamaya le phokotso ya PSII ya di-quinone (39, 40). Ka jalo, fa go akanngwa ka tshomarelo ya thutotlhagelelo ya RC, mokgwa ono wa go tlama o o neng o sa lemogiwe pele o ka nna wa dira le mo lefelong la QB la PSII RC mo dimeleng tsa phototrophic tse di nang le okosejene.
Rps ΔpufW (go phimolwa ga pufW go go sa tshwailweng) le PufW-His (poroteine-W e e tshwailweng ya C-terminal 10x His e e tlhagisitsweng go tswa mo locus ya tlholego ya pufW) mefuta. palustris CGA009 e ne ya tlhalosiwa mo tirong ya rona e e fetileng (16). Mefuta eno le motsadi wa mofuta wa naga wa isogenic di ne tsa bonwa mo setsidifatsing ka go tshwaya palo e nnye ya disele mo PYE (litara nngwe le nngwe ya 5 g -1) (e e bolokilweng mo LB ka -80 °C, e e nang le poroteine ​​ya 50% ( w/v) ya glycerol, tlhotlhori ya tomoso le succinate (%] agar/w 5. Sejana se ne sa tlhokomelwa bosigo jotlhe mo lefifing ka themperetšha ya phaposi mo maemong a a senang mowa, mme morago ga moo sa bonesiwa ka lesedi le lesweu (~50 μmolm-2 s-1) le le tlametsweng ke ditleloupu tsa halogen tsa OSRAM 116-W (RS Components, UK) malatsi a le 3 go ya go a le 5 go fitlha go tlhagelela koloni e le nngwe. Koloni e le nngwe e ne ya dirisiwa go enta 10 ml ya M22+ magareng (41) e e tlaleleditsweng ka 0.1% (w/v) ya diesiti tsa casamino (e e tla bidiwang M22 morago ga fa). Setso se ne sa jalwa mo maemong a a kwa tlase a okosejene mo lefifing ka 34°C ka go roroma ka 180 rpm diura di le 48, mme morago ga moo 70 ml ya setso e ne ya entiwa mo maemong a a tshwanang diura di le 24. Setso sa seka-aerobic se se nang le bolumu ya 1 ml se dirisiwa go enta 30 ml ya sediriswa sa M22 mo lebotlolong la galase le le bonaletsang le le nang le sekurufu sa 30 ml le go phatsima ka go fuduega (~50μmolm-2 s-1) diura di le 48 ka maatla a makenete a a senang megare Stirring rod. Morago ga moo 30 ml ya setso e ne ya enta ka litara e e ka nnang 1 ya setso mo maemong a a tshwanang, e e neng ya dirisiwa go enta dilitara di ka nna 9 tsa setso se se bonesitsweng ka ~200 μmolm-2 s-1 diura di le 72. Disele di ne tsa kotulwa ka go tlhotlhora kwa 7132 RCF metsotso e le 30, tsa tlhongwa gape mo ~10 ml ya 20 mM tris-HCl (pH 8.0), mme tsa bolokwa kwa -20°C go fitlha go tlhokega.
Morago ga go thapolola, tsenya dikristale dingwe tsa deoxyribonuklease I (Merck, UK), lysozyme (Merck, UK) le dipilisi tse pedi tsa thibela-porotease ya holoenzyme ya Roche (Merck, UK) mo diseleng tse di tlhomilweng gape. Mo seleng ya kgatelelo ya Fora ya 20 000 psi (Aminco, USA), disele di ne tsa kgoreletsega makgetlo a le 8 go ya go a le 12. Morago ga go tlosa disele tse di sa thubegang le matlakala a a sa tlhotlhoregeng ka go tlhotlhora kwa 18,500 RCF metsotso e le 15 kwa 4°C, lera le ne la tlhotlhorega go tswa mo lysate e e nang le mmala ka go tlhotlhora kwa 113,000 RCF diura di le 2 kwa 43,000°C. Latlha karolwana e e tlhotlhoregang mme o tlhome gape lera le le mmala mo 100 go ya go 200 ml ya 20 mM tris-HCl (pH 8.0) mme o e homogenize go fitlha go se na di-aggregate tse di bonalang. Lera le le emisitsweng le ne la tlhokomelwa mo tris-HCl ya 20 mM (pH 8.0) (Anatrace, USA) e e nang le 2% (w/v) β-DDM ura e le 1 mo lefifing kwa 4°C ka go fuduwa ka bonolo. Go tswa foo centrifuge ka 70°C go tlhaolosa 150,000 RCF ka 4°C ura e le 1 go tlosa masalela a a sa tlhaologeng.
Lera le le tlhotlhoregang go tswa mo mofuteng wa ΔpufW le ne la dirisiwa mo kholomong ya phapantsho ya ione ya DEAE Sepharose ya 50 ml e e nang le dibolumo tse tharo tsa kholomo (CV) tsa sethibela-HCl se se tlamang [20 mM tris-HCl (pH 8.0) e e nang le 0.03% (w / v) β-DDM]. Hlatswa kholomo ka dithibela tse pedi tse tlamang tsa CV, ebe o hlatswa kholomo ka dithibela tse pedi tse tlamang tse nang le 50 mM NaCl. Motswako wa RC-LH116 o ne wa tlhotlhiwa ka mothalo wa mola wa 150 go ya go 300 mM NaCl (mo sethibelong se se tlamang) mo 1.75 CV, mme motswako o o setseng wa go tlama o ne wa tlhotlhiwa ka sethibela se se tlamang se se nang le 300 mM NaCl mo 0.5 CV. Kgobokanya sepektheramo sa monyelo magareng ga 250 le 1000 nm, boloka karolwana e e nang le tekanyetso ya monyelo (A880/A280) e e fetang 1 kwa 880 go ya go 280 nm, e tlhaolose gabedi mo sethibelong se se tlamang, mme o dirise tsamaiso e e tshwanang gape mo kholomong ya DEAE Ka go itshekisa. Hlatswa dikarolwana tse nang le ditekanyetso tsa A880/A280 tse phahameng ho feta 1.7 le ditekanyetso tsa A880/A805 tse phahameng ho feta 3.0, etsa potoloho ya boraro ya phapanyetsano ya ione, mme o boloke dikarolwana tse nang le ditekanyetso tsa A880/A280 tse phahameng ho feta 2.2 le ditekanyetso tsa A880/A805 tse hodimo ho feta 0. Motswako o o phepafaditsweng ka bontlhabongwe o ne wa tsepamisiwa go fitlha go ~2 ml mo setlhotlhing sa bokete jwa dimolekhule jwa Amicon 100,000 (MWCO) (Merck, UK), mme sa laisiwa mo kholomong ya bogolo jwa Superdex 200 16/600 e e sa akarediweng (GE Healthcare, US) e e nang le buffer ya NaM thelume mo 1.5 CV Kgobokanya mebalabala ya monyelo ya karolwana ya bogolo jwa go se akarediwe, mme o tsepamise mebalabala ya monyelo ka ditekanyetso tsa A880/A280 go feta 2.4 le ditekanyetso tsa A880/A805 go feta 5.8 go ya go 100 A880, mme ka bonako o di dirise go baakanyetsa keriti ya cryo-TEM kgotsa go di boloka until80.
Lera le le tswakanyang go tswa mo mofuteng wa PufW-His le ne la dirisiwa mo kholomong ya Sepharose ya HisPrep FF Ni-NTA ya 20 ml (20 mM tris-HCl (pH 8.0) e e nang le NaCl ya 200 mM le 0.03% (bokete/bokete)) mo sethibelong sa Boitekanelo ( GE). v) β-DDM]. Kholomo e ne ya tlhatswiwa ka di-CV di le tlhano tsa sethibela-metsi sa IMAC, mme morago ga moo ka di-CV di le tlhano tsa sethibela-metsi sa IMAC se se nang le histidine ya 10 mM. Motswako wa konokono o ne wa ntshiwa mo kholomong ka dithibela-madi tse tlhano tsa IMAC tse di nang le histidine ya 100 mM. Karolwana e e nang le motswako wa RC-LH114-W e tsepamisitswe go fitlha go ~10 ml mo tankeng e e tlhotlheleditsweng e e nang le setlhotlhi sa Amicon 100,000 MWCO (Merck, UK), e tlhaolosiwa makgetlo a le 20 ka sethibela-malwetse se se tlamang, mme morago ga moo e tsenngwa mo sethibelang-metsi se se tlamang sa 25 ml Mo sethibela-metsi sa DEAE b go sa le gale. Hlatswa kholomo ka dithibela-mafura tse nne tsa ho tlama tsa CV, ebe o hloekisa motswako hodima di-CV tse robedi hodima mothalo wa mola wa 0 ho isa ho 100 mM NaCl (ka sethibela-mafura sa ho tlama), mme di-CV tse nne tse setseng tse nang le sethibela-mafura sa ho tlama sa 100 mM Di-complex tse setseng tsa chlobin A8de0 di hlahisitswe hodima motswako wa A8de2. e e kwa godimo ga 2.4 le selekanyo sa A880/A805 se se kwa godimo ga 4.6 dikarolwana di ne tsa kokoanngwa go fitlha go ~2 ml mo setlhotlhing sa Amicon 100,000 MWCO sa centrifugal, mme tsa tladiwa ka 1.5 CV IMAC go sa le gale Buffer e ne ya lekalekanya Superdex 200 e e neng ya tsenngwa mo godimo ga 16/600. 1.5 CV Kgobokanya mebalabala ya monyelo ya dikarolwana tsa bogolo-go se akarediwe mme o tsepamise mebalabala ya monyelo ka ditekanyetso tsa A880/A280 go feta 2.1 le ditekanyetso tsa A880/A805 go feta 4.6 go ya go 100 A880, tse di dirisiwang ka bonako go baakanyetsa keriti ya TEM e e gatseditsweng kgotsa go bolokwa go fitlha go -80°C.
Go ne ga dirisiwa setsidifatsi sa go inela sa Leica EM GP go baakanya dikiriti tsa TEM tsa themperetšha e e kwa tlase. Motswako o ne wa tlhaolosiwa mo sethibelong sa IMAC go ya go A880 ya 50, mme morago ga moo 5μl e ne ya laisiwa mo letloeng la kopore le le sa tswang go phatsima la QUANTIFOIL 1.2/1.3 le le apesitsweng ka khabone (Agar Scientific, UK). Hlahisa keriti ka 20°C le 60% ya mongobo o amanang le 30 s, ebe o e omisa bakeng sa 3 s, ebe o e tima ka ethane e metsi ka -176°C.
Tshedimosetso ya RC-LH114-W e e raraaneng e ne ya kwalwa mo eBIC (Setheo sa Eleketeroniki sa Bioimaging) (Motswedi wa Lesedi la Taemane ya Boritane) ka maekerosekopo ya Titan Krios, e e dirang ka maatla a a potlakisang a 300kV, ka kgodiso e e kwa tlase ya Choose ga 130,000 ya e-V × le Gatan 968 GIF Quantum e e nang le sesupo sa tlhora ya K2 e ne ya dirisiwa go rekota ditshwantsho ka mokgwa wa go bala go kokoanya tshedimosetso. Bogolo jwa dipiksele jo bo lekanyeditsweng ke 1.048Å, mme selekanyo sa selekanyo ke 3.83 e-Å-2s-1. O ne a kokoanya baesekopo eno ka metsotswana e le 11 mme a e kgaoganya ka dikarolo di le 40. Dirisa lefelo le le apesitsweng khabone go tsepamisa maekerosekopo gape, mme morago ga moo o kokoanye dibaesekopo di le tharo mo lehuting lengwe le lengwe. Ka kakaretso, dibaesekopo di le 3130 di ne tsa kokoanngwa, ka boleng jwa defocus jo bo fa gare ga -1 le -3μm.
Tshedimosetso ya RC-LH116 e e raraaneng e ne ya kokoanngwa go dirisiwa maekerosekopo e e tshwanang kwa Laboratoring ya Popego ya Ditshedi ya Asterbury (Yunibesithi ya Leeds, UK). Tshedimosetso e ne ya kokoanngwa ka mokgwa wa go bala ka kgodiso ya 130 k, mme bogolo jwa dipiksele bo ne jwa lekanyediwa go 1.065 Å ka selekanyo sa 4.6 e-Å-2s-1. Filimi eno e ne ya gatisiwa mo metsotswaneng e le 12 mme ya kgaoganngwa ka dikarolo di le 48. Ka kakaretso, difilimi di le 3359 di ne tsa kokoanngwa, ka boleng jwa defocus jo bo fa gare ga -1 le -3μm.
Tshebetso yohle ya data e etswa ka hara peipi ya Relion 3.0 (42). Dirisa Motioncorr 2 (43) go baakanya motsamao wa matlhasedi ka go lekanya bokete jwa selekanyo, mme morago o dirise CTFFIND 4.1 (44) go bona paramente ya CTF (tiro ya phetiso ya pharologano). Difotomaekrokerafo tse di tlwaelegileng morago ga dikgato tseno tsa ntlha tsa go dira di bontshiwa mo Setshwantshong 2. S16. The jarolla ka ho iketsa kgetho thempleite e hlahiswa ka letsoho khetha ka bang 250 dipikselse tsa 1000 dikarolwana ka 250-pikselse foreimi le ha ho na tshupiso tse peli-tlhakore (2D) tlhophiso, ka tsela eo hana tseo dihlopha hore kopana le sampole kgotlelo kapa ha ho le dipharologantsho discernible. Go tswa foo, go ne ga dirwa tlhopho e e itirisang mo dinepeng tsotlhe tse dinnye, mme RC-LH114-W e ne e le dikarolwana di le 849 359, mme RC-LH116 e e raraaneng e ne e le dikarolwana di le 476 547. Dikarolwana tsotlhe tse di tlhophilweng di dirile ditikologo tse pedi tsa go tlhaolwa ga 2D go go sa supiweng, mme morago ga go taboga gongwe le gongwe, dikarolwana tse di kopanang le lefelo la khabone, kgotlhelo ya sampole, go se na diponagalo tse di bonalang kgotsa dikarolwana tse di tshwaraganeng thata di a ganwa, mme seno se felela ka gore go nne le tiriso ya 772,033 (90.9%) le 359,678 ya dikarolwana D )d. RC-LH114-W le RC-LH116 ka go latelana. Mofuta wa tshupiso wa ntlha wa 3D o ne wa tlhagisiwa ka go dirisa mokgwa wa go fologa wa stochastic gradient. Ho sebedisa mohlala wa pele e le tshupiso, dikarolwana tse kgethilweng di arotswe ka dihlopha tse nne ka 3D. Ho sebedisa ea mohlala ka sehlopha sena e le tshupiso, etsa 3D ntlafatso ka dikarolwana tse ka sehlopha se seholo ka ho fetisisa, ebe sebelisa pele 15Å tlaase-feta filthara ho koahela solvent sebakeng, eketsa 6 dipikselse tsa metshetshe bonolo, 'me morago ga tshebetso dipikselse ho lokisa Gatan K2 transfer function tlhōrō Mo. Bakeng sa RC-LH114-W dataset, ena ea pele ea mohlala e ne e fetotsoe ka ho tlosa matla segokanyipalo ka metshetshe ea maske (e kgaotswe ho tswa ho segokanyipalo sa konokono se rarahaneng ka UCSF Chimera). Dikai tse di tlholang (ditshwetso tsa RC-LH114-W le RC-LH116 ke 3.91 le 4.16 Å, ka go latelana) di dirisiwa jaaka tshupiso ya tikologo ya bobedi ya go tlhaola 3D. Dikarolwana tse di dirisitsweng di tlhophilwe mo setlhopheng sa ntlha sa 3D mme ga di na kamano e e maatla le boagisani. Go kopana kgotsa go tlhoka diponagalo tse di bonalang tsa popego. Morago ga tikologo ya bobedi ya go tlhaola 3D, go ne ga tlhophiwa setlhopha se se nang le resolushene e e kwa godimo [Mo go RC-LH114-W, setlhopha se le sengwe ke dikarolwana di le 377,703 (44.5%), mo go RC-LH116, go na le ditlhopha tse pedi fela, fa palogotlhe ya tsone e le dikarolwana di le 260,752. morago ga go dikologa ga ntlha ka pharologano e nnye]. Dikarolwana tse di tlhophilweng di ntshiwa gape mo lebokosong la dipiksele di le 400 mme di ntlafadiwa ka go ntlafadiwa ga 3D. The solvent maske e hlahiswa sebelisa pele 15Å tlaase-feta filthara, 3 dipikselse mmapa katoloso le 3 dipikselse maske bonolo. Ho sebedisa ka-karolwana CTF ntlafatso, ka-karolwana tshisinyo tokiso le potoloho ya bobedi ya ka-karolwana CTF ntlafatso, 3D ntlafatso, solvent masking le morago ga tshebetso di etswa ka mor'a e mong le e kgato ho ntlafatsa ho feta sephetho le ponahalo. Ho sebedisa boleng bo kgaotsweng ba FSC (Selekanyo sa Kgolagano ya Kgapetla ya Fourier) ba 0.143, diqeto tsa dikai tsa ho qetela tsa RC-LH114-W le RC-LH116 ke 2.65 le 2.80Å, ka ho latellana. Sebopego sa FSC sa sekao sa bofelo se bontshiwa mo Setshwantshong 2. S17.
Ditatelano tsotlhe tsa diporoteine ​​di laisololwa go tswa mo UniProtKB: LH1-β (PufB; ID ya UniProt: Q6N9L5); LH1-α (PufA; ID ya Ditshenyegelo tsa Bongwe: Q6N9L4); RC-L (PufL; ID ya UniProt: O83005); RC-M (PufM; ID ya UniProt: A0A4Z7); RC-H (PuhA; ID ya UniProt: A0A4Z9); Poroteine-W (PufW; ID ya Poroteine ​​e le nngwe: Q6N1K3). SWISS-MODEL (45) e ne ya dirisiwa go aga sekao sa homology sa RC, se se nang le tatelano ya diporoteine ​​tsa RC-L, RC-M le RC-H le popego ya kristale ya Rba. RC e ne e dirisiwa jaaka thempoleite (ID ya PDB: 5LSE) (46). Dirisa sedirisiwa sa “mmapa o o tshwanelang” mo UCSF Chimera go tshwanela sekao se se tlhagisitsweng mo mmapeng (47), tokafatsa popego ya poroteine, le cofactor [4×BChl a (leina la masalela a laeborari ya monomere = BCL), 2×BPh a (BPH), mofuta o le mongwe kgotsa e mebedi ya UQ10 (U10), e le nngwe e e seng ya heFme le 3,4-dihaeteroheksakarbonilekoline (QAK)] dirisa Coot (48) go oketsa. Kaha QAK ha e fumanehe laeboraring ya monomer, e ne e hlophisitswe ho sebediswa sesebediswa sa eLBOW ho PHENIX (49).
Morago ga moo, go ne ga agiwa yunitipotlana ya LH1. Kwa tshimologong, sedirisiwa sa go aga se se itirisang mo PHENIX (49) se ne sa dirisiwa go aga karolo ya tatelano ya LH1 ka go itirisa go dirisiwa mmapa le tatelano ya diporoteine ​​tsa LH1-α le LH1-β jaaka tshedimosetso. Tlhopha yunitipotlana ya LH1 e e feletseng thata, e ntshe mme o e laise mo Coot, o tsenye tatelano e e tlhaelang mo go yone ka seatla, mme o ntlafatse popego yotlhe ka seatla pele o tsenya di-BCls tse pedi a (BCL) le spirilloxanthin (CRT) [go ya ka Rps e e maleba Kitlano ya diteng tsa carotenoid tsa LH1 le tse di itsiweng. Mefuta (17)]. Kopolola yunitipotlana e e feletseng ya LH1, mme o dirise “Sediriswa sa Mmapa wa go Ema” sa UCSF Chimera go emisa mo lefelong le le bapileng le le seng la sekao la kitlano ya LH1, mme morago o e tokafatse mo Coot; boeletsa thulaganyo go fitlha diyunitipotlana tsotlhe tsa LH1 di dirilwe sekao. Bakeng sa sebopeho sa RC-LH114-W, ka ho ntsha segokanyipalo se sa abelwang ka Coot, protheine e arotswe ho tswa ho dikarolo tse setseng tseo e seng tsa protheine mmapeng wa USCF Chimera mme sesebediswa sa Autobuild se sebediswa ho theha mohlala wa pele, mme diyuniti tse nyane tse setseng (protheine-W) Modeling. Mo go FENISE (49). Tsenya tatelano epe e e tlhaelang mo sekaong se se tlholang mo Coot (48), mme morago ga moo o ntlafatse yunitipotlana yotlhe ka seatla. Kitlano e e setseng e e sa abewang e tshwanela motswako wa dilipidi (ID ya laeborari ya monomere ya PDB ya CDL = CDL, POPC = 6PL le POPG = PGT), sesepa sa β-DDM (LMT) le dimolekhule tsa UQ10 (U10). Dirisa PHENIX tokafatso (49) le tokafatso ya diatla mo Coot (48) go itekanela sekao sa ntlha se se feletseng go fitlha dipalopalo tsa sekao le boleng jwa pono jwa go tshwanelega bo ka se tokafadiwe go ya pele. La bofelo, dirisa LocScale (50) go lootsa mmapa wa selegae, mme morago ga moo o dire dipotologo tse dingwe di le mmalwa tsa go dira sekao sa kitlano e e sa abewang le go tokafatsa ka go itirisa le ka diatla.
Dipeptide tse di farologaneng, di-cofactor le dilipidi tse dingwe le di-quinone tse di tsenngwang mo teng ga kitlano ya tsona ka go farologana di bontshiwa mo Ditshwantshong 1 le 2. S18 go ya go S23. Tshedimosetso ya dipalopalo ya sekao sa bofelo e bontshiwa mo Lenaneong S1.
Ntle le fa go tlhalositswe ka tsela e sele, mebala ya go monya UV/Vis/NIR e ne ya kokoanngwa mo sebakeng sa Cary60 (Agilent, USA) ka dikgaotso tsa 1 nm go tswa go 250 nm go ya go 1000 nm le nako ya go kopanngwa ya 0.1s.
Hlatswa sampole ka cuvette ya quartz e nang le tsela ya 2 mm ho A880 ya 1, mme o bokelle sepektheramo sa monyelo pakeng tsa 400 le 1000 nm. Ditshwantsho tse di sediko tsa di-dichroic di ne tsa kokoanngwa mo setshwantshong sa Jasco 810 (Jasco, Japane) ka dikgaotso tsa 1 nm fa gare ga 400 nm le 950 nm ka seelo sa go sekaseka sa 20 nm motsotso-1.
Segokanyipalo sa go nyelela ga molar se laolwa ka go tlhatswa motswako wa konokono go nna A880 e e ka nnang 50. Tlhatswa bolumu ya 10μl mo sethibelang se se tlamang sa 990μl kgotsa methanol, mme o kokoanye sebopego sa monyelo ka bonako go fokotsa go senyega ga BChl. Diteng tsa BChl tsa sampole nngwe le nngwe ya methanol di ne tsa balelwa ka segokanyipalo sa go nyelela kwa 771 nm ya 54.8 mM-1 cm-1, mme segokanyipalo sa go nyelela se ne sa tlhomamisiwa (51). Arola selekanyo sa BChl se se lekanyeditsweng ka 32 (RC-LH114-W) kgotsa 36 (RC-LH116) go bona selekanyo sa konokono se se raraaneng, se morago ga moo se dirisiwang go bona sebopego sa monyelo sa sampole e e tshwanang e e kokoantsweng mo segokanyipalong sa go nyelela ga buffer. bapa. Ditekanyo tse tharo tse pheta-phetwang di ile tsa nkuwa bakeng sa sampole e nngwe le e nngwe, mme palohare ya monyelo ya boholo ba BChl Qy e ile ya sebediswa bakeng sa ho bala. Segokanyipalo sa go nyelela ga RC-LH114-W se se lekanyeditsweng kwa 878 nm ke 3280±140 mM-1 cm-1, fa segokanyipalo sa go nyelela ga RC-LH116 se se lekanyeditsweng kwa 880 nm e le 3800±30 mM-1 cm-1.
UQ10 e ne ya lekanngwa go ya ka mokgwa o o mo go (52). Ka bokhutshwane, HPLC ya legato le le boelang morago (RP-HPLC) e ne ya dirwa go dirisiwa thulaganyo ya HPLC ya Agilent 1200. Tlhatswa mo e ka nnang 0.02 nmol ya RC-LH116 kgotsa RC-LH114-W mo 50μl ya methanolo:tlelorofomo ya 50:50 e e nang le tleloraete ya tshipi ya 0.02% (w/v), mme o tlhabele tleloraete ya tshipi e e lekalekantsweng pele mo m1. 40°C mo setlhaolosing sa HPLC (80:20 methanole:2-poropanolo) mo kholomong ya ×25 cm. Dira go tlhotlhora ga isocratic mo setlhaolosing sa HPLC go ela tlhoko monyelo kwa 275 nm (UQ10), 450 nm (dikharotenoid) le 780 nm (BChl) ura e le 1. Setlhoa mo chromatogram ya 275 nm ka metsotso e le 25.5 se ne sa kopanngwa, se se neng se sena metswako epe e mengwe e e ka lemogiwang. Lefelo le le kopantsweng le dirisiwa go bala selekanyo sa molar sa UQ10 se se ntshitsweng go lebilwe sebopego sa tekanyetso se se balelwang go tswa mo go tlhabeng ga maemo a a phepa go tswa go 0 go ya go 5.8 nmol (Setshwantsho S14). Sampole e nngwe le e nngwe e ne ya sekasekwa ka dipoeletso tse tharo, mme phoso e e begilweng e tsamaisana le SD ya palogare.
Tharabololo e e nang le motswako wa RC-LH1 o o nang le monyelo o o kwa godimo wa Qy wa 0.1 e ne ya baakanngwa ka 30 μM e e fokoditsweng ya pelo ya pitse ya cytochrome c2 (Merck, UK) le 0 go ya go 50 μMUQ2 (Merck, UK). Disampole tse tharo tsa 1-ml di ne tsa baakanngwa mo kgobokanong nngwe le nngwe ya UQ2 mme tsa tlhokomelwa bosigo jotlhe mo lefifing ka 4°C go netefatsa go tlwaela gotlhelele mo lefifing pele ga tekanyetso. Tharabololo e ne ya tsenngwa mo sepektherofotomethareng ya dimojule ya OLIS RSM1000 e e nang le sediriswa sa 300 nm sa kgabo/mola wa 500, diphatlha tsa go tsena tsa 1.24 mm, tsa fa gare tsa 0.12 mm le tsa go tswa tsa 0.6 mm. Setlhotlhi sa go feta sa 600 nm se se telele se bewa kwa kgorong ya phototube ya sampole le tšhupu ya photomultiplier ya tshupiso go se akaretse lesedi la go tsosa. Monyelo o ne o bewa leitlho kwa 550 nm ka nako ya go kopanngwa ga 0.15 s. Lesedi la go tlhotlheletsa le ntshiwa go tswa mo LED ya 880 nm M880F2 (Diode e e Ntshetsang Lesedi) (Thorlabs Ltd., UK) ka thapo ya faeba ya optiki ka maatla a 90% ka molaodi wa DC2200 (Thorlabs Ltd., UK) mme le ntshiwa mo motsweding wa lesedi ka angle ya9. Lesedi la go lekanya le kgatlhanong le seipone go busetsa lesedi lengwe le lengwe le le neng le sa monyelwe ke sampole kwa tshimologong. Ela tlhoko monyelo 10 s pele ga go bonesa ga 50 s. Morago ga moo monyelo o ne wa bewa leitlho gape ka 60 s mo lefifing go sekaseka selekanyo se quinolol e fokotsang cytochrome c23 + ka go itiragalela fela go le kana kang (bona Setshwantsho S8 go bona tshedimosetso e e tala).
Tshedimosetso e ne ya dirisiwa ka go tshwanela seelo sa ntlha sa mola mo gare ga 0.5 go ya go 10 s (go ikaegile ka kgobokano ya UQ2) le go dira palogare ya dikelo tsa disampole tsotlhe tse tharo mo kgobokanong nngwe le nngwe ya UQ2. Mothamo wa RC-LH1 o o balelwang ke segokanyipalo sa go nyelela se se farologaneng o ne wa dirisiwa go fetolela seelo go nna bokgoni jwa setlhotlheletsi, se se rulagantsweng mo Origin Pro 2019 (OriginLab, USA), mme sa tsenngwa mo sekaong sa Michaelis-Menten go bona boleng jo bo bonalang jwa Km le Kcat.
Bakeng sa ditekanyetso tsa ho monya tsa nakwana, sampole ya RC-LH1 e ne e fokotswa ho ~ 2 μM ka sethibela-mafu sa IMAC se nang le 50 mM ya ascorbate ya sodiamo (Merck, USA) le 0.4 mM ya Terbutin (Merck, USA). Ascorbic acid e dirisiwa jaaka moneela-eleketerone wa setlhabelo, mme tert-butaclofen e dirisiwa jaaka thibela-QB go netefatsa gore moneela-mogolo wa RC o nna a fokoditswe (ke gore, a sa photooxidized) mo thulaganyong yotlhe ya go lekanya. Mo e ka nnang 3 ml ya sampole e okediwa mo seleng e e dikologang e e tlwaelegileng (e e ka nnang 0.1 m ka bophara, 350 RPM) e e nang le boleele jwa tsela ya optical ya 2 mm go netefatsa gore sampole e e mo tseleng ya laser e na le nako e e lekaneng ya go tlwaela lefifi fa gare ga dipulse tsa go tlhotlheletsa. Dirisa dipulse tsa laser tsa ~100-fs go godisa thulaganyo ya laser ya Ti: Safira (Spectra Physics, USA) go tlhotlheletsa sampole ka 880 nm ka seelo sa poeletso sa 1 kHz (20 nJ ya NIR kgotsa 100 nJ ya Vis). Pele o kokoanya tshedimosetso, tsenya sampole mo leseding la go tlhotlheletsa metsotso e ka nna 30. Go tlhagelela go tla baka go sa dire ga QA (gongwe go fokotsa QA gangwe kgotsa gabedi). Mme tsweetswee ela tlhoko gore thulaganyo eno e ka busediwa morago ka gonne morago ga nako e telele ya go tlwaela lefifi, RC e tla boela kwa tirong ya QA ka iketlo. Sepekterometara sa Helios ( Ultrafast Systems , USA ) se ne sa dirisiwa go lekanya mebalabala ya nakwana e e nang le nako ya tiego ya -10 go ya go 7000 ps . Dirisa serweboleta sa Surface Xplorer (Ditsamaiso tsa Ultrafast, USA) go tlhaola disete tsa tshedimosetso, o bo o di kopanya le go di dira gore di tshwane. Dirisa sephuthelwana sa sofotewere ya CarpetView (Light Conversion Ltd., Lithuania) go dirisa sete ya tshedimosetso e e kopantsweng go bona mebala e e farologaneng e e amanang le go bola, kgotsa dirisa tiro e e akaretsang ditshupo tse dintsi tse di nang le karabo ya sedirisiwa go tshwanela phetogo ya mebala ya boleele jwa makhubu a le mangwe mo Origin, USALa (Origin).
Jaaka go umakilwe fa godimo (53), go ne ga baakanngwa filimi ya photosynthesis e e nang le LH1 complex e e tlhaelang antenna ya RC le ya LH2 e e kwa ntle. Lera le ne la tlhaolosiwa ka 20 mM tris (pH 8.0) mme morago ga moo la laisiwa mo cuvette ya quartz e e nang le tsela ya pono ya 2 mm. Go ne ga dirisiwa go itaya ga laser ga 30nJ go tlhotlheletsa sampole kwa 540 nm ka nako ya tiego ya -10 go ya go 7000 ps. Tshebetsa sete ya data jwalo ka ha ho hlalositswe bakeng sa Rps. pal sampole.
Lera le ne la tlhotlhelediwa ka go tlhotlhorega ka 150,000 RCF diura di le 2 ka 4°C, mme morago ga moo go monyelwa ga lone ka 880 nm go ne ga tlhongwa gape mo 20 mM tris-HCl (pH 8.0) le 200 mM NaCl. Phatlalatsa lera ka go fuduwa ka iketlo mo 2% (w/v) β-DDM ura e le 1 mo lefifing ka 4°C. Sampole e ne ya tlhaolosiwa ka khaboneite ya 100 mM ya triethylammonium (pH 8.0) (TEAB; Merck, UK) go fitlha kwa kgobokanong ya poroteine ​​ya 2.5 mg ml-1 (tshekatsheko ya Bio-Rad). Go ne ga dirwa tiro e nngwe go tswa mo mokgweng o o gatisitsweng pele (54), go simolola ka go tlhatswa poroteine ​​ya 50 μg go nna palogotlhe ya 50 μl ya TEAB e e nang le 1% (w/v) ya sodium laurate (Merck, UK). Morago ga sonication ya 60 s, e ne ya fokodiwa ka 5 mM tris (2-khaboksiethyl) fosphine (Merck, UK) ka 37 ° C ka metsotso e le 30. Bakeng sa S-alkylation, hlahisa sampole ka 10 mM ya methyl S-methylthiomethanesulfonate (Merck, UK) mme o e eketse ho tswa ho tharollo ya setoko sa isopropanol ya 200 mM metsotso e 10 ka themphereitjha ya phaposi. Tshilo ya dijo ya poroteine ​​e ne ya dirwa ka go tsenya 2 μg ya motswako wa trypsin/endoproteinase Lys-C (Promega UK) mme ya tlhokomelwa ka 37°C diura di le 3. Sediriswa sa boalogodimo sa laurate se ne sa ntshiwa ka go tsenya 50 μl ya ethyl asetate le 10 μl ya 10% (v/v) ya esiti ya trifluoroasetiki ya seemo sa LC (TFA; Thermo Fisher Saense, UK) le go e dikolosa sebaka sa 60 s. Kgaogano ya legato e ne ya rotloediwa ke go tlhotlhora ka 15,700 RCF metsotso e le 5. Ho ya ka prothokholo ya moetsi, kholomo ya C18 spin (Thermo Fisher Scientific, UK) e ne e sebediswa ho hema le ho ntsha letswai ka hloko karolong e ka tlase e nang le peptide. Morago ga go omisa ka go tlhotlhora ga lerole, sampole e ne ya tswakanngwa mo 0.5% TFA le 3% ya acetonitrile, mme 500 ng e ne ya sekasekwa ka chromatography ya nanoflow RP e e kopantsweng le spectrometry ya bontsi go dirisiwa dipharametara tsa tsamaiso tse di tlhalositsweng ka botlalo pelenyana.
Dirisa MaxQuant v.1.5.3.30 (56) go supa poroteine ​​le go e lekanya go batla Rps. polokelotshedimosetso ya diporoteome tsa palustris (www. Tshedimosetso ya diporoteomiki tsa sepektherometri sa bokete e tsentswe mo Selekanong sa ProteomeXchange ka polokelo ya balekane ba PRIDE (http://proteomecentral.
Bakeng sa tlhahlobo ke RPLC e kopantsweng le spectrometry ya boima ba ionization ya electrospray, motswako wa RC-LH1 o ne o lokiseditswe ho tswa ho Rps ya mofuta o hlaha. Ka go dirisa mokgwa o o gatisitsweng pele (16), selekanyo sa poroteine ​​se se tlhagisitsweng mo diseleng tsa palustris e ne e le 2 mg ml-1 mo Hepes ya 20 mM (pH 7.8), NaCl ya 100 mM le 0.03% (w/v) β- (tshekatsheko ya Bio-Rad) ) DDM. Go ya ka porothokholo ya motlhagisi, dirisa sediriswa sa go itshekisa sa 2D (GE Healthcare, USA) go ntsha poroteine ​​ya 10 μg ka mokgwa wa go ntsha pula, mme o tlhaolose tlhotlhorego mo 20 μl ya 60% (v / v) ya esiti ya formiki (FA), 20% (v / v) ya Acetonitrile/ 20% ya metsi. Di-microliter tse hlano di ile tsa sekasekwa ke RPLC (Dionex RSLC) e kopantsweng le sepektherometri sa boima (Maxis UHR-TOF, Bruker). Dirisa kholomo ya MabPac ya 1.2×100 mm (Thermo Fisher Scientific, UK) go kgaoganya ka 60°C le 100μlmin -1, ka mothalo wa 85% (v / v) ya setlhaolosi A [0.1% (v / v) FA le 0.02% (V/v) tharabololo ya B8v a [0.1% (v / v) FA le 0.02% (v / v) mo 90% (v / v) asetonitrile TFA] Go dirisa motswedi o o tlwaelegileng wa ionization ya motlakase le dipharametara tsa thulaganyetsoruri metsotso e e fetang 60, sepekterometara sa bokete se bona 100 go ya go 2750 m / z (tekanyetso ya bokete-go-tšhatšhe). Ka thuso ya sediriswa sa FindPept sa portal ya didirisiwa tsa tshedimosetso ya ditshedi ya ExPASy (https://web.expasy.org/findpept/), dira mmapa wa sebopego sa bontsi go ya kwa diyunitingpotlana tsa lefelo le le raraaneng.
Disele di ne tsa godisiwa diura di le 72 ka fa tlase ga lesedi la 100 ml la NF-tlase (10μMm-2 s-1), le le magareng (30μMm-2 s-1) kgotsa le le kwa godimo (300μMm-2 s-1). M22 mahareng (M22 mahareng ao ho ona ammonium sulfate e tlohetsweng mme sodiamo succinate e nkelwa sebaka ke sodiamo asetate) ka botlolo ya 100 ml e nang le sekurufu-hodimo (23). Mo dipopegong tse tlhano tsa 30-s, dipheta tsa galase tsa 0.1 micron di ne tsa tsenngwa dipheta ka tekanyetso ya bolumu ya 1:1 go lyse disele le go tsidifadiwa mo aese metsotso e le 5. Selo se se sa tlhotlhoregeng, disele tse di sa thubegang le dipheta tsa galase di ne tsa tlosiwa ka go tlhotlhora mo 16,000 RCF metsotso e le 10 mo microcentrifuge e e mo godimo ga tafole. Lera le ne la kgaoganngwa mo rotoreng ya Ti 70.1 e e nang le RCF ya 100 000 mo tris-HCl ya 20 mM (pH 8.0) e e nang le 40/15% (w/w) ya sucrose e e nang le diura di le 10.
Jaaka go tlhalositswe mo tirong ya rona e e fetileng, go tlhatlhoba ga theke ya Gagwe mo PufW (16). Ka bokhutshwane, motswako wa konokono o o phepafaditsweng (11.8 nM) kgotsa lera le le nang le kgobokano e e tshwanang ya RC (e e laolwang ke oxidation e e ntshang sepektheramo sa pharologano e e fokoditsweng le go tshwantshanya morwalo mo gel e e nang le lebala) mo 2x SDS loading buffer (Merck, UK) e e tlhapolotsweng gabedi. Diporoteine ​​di ne tsa kgaoganngwa mo jeleng ya NuPage ya 12% ya bis-tris (ya saense ya Thermo Fisher, UK). Gele e ne ya tshasiwa ka Botala jwa Legodimo jo bo Botlhale jwa Coomassie (Bio-Rad, UK) go laisa le go bona ka leitlho la mogopolo yunitipotlana ya RC-L. Poroteine ​​e e mo jeleng ya bobedi e ne ya fetisediwa kwa leraleng la polyvinylidene fluoride (PVDF) le le dirisiwang ke methanol (Thermo Fisher Scientific, UK) go dira diteko tsa go lwantsha malwetse. Lera la PVDF le ne la thibelwa mo 50 mM tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 0.2% (v / v) Tween-20 le 5% (w / v) mashi a a tlhotlhilweng a a phofshwana, mme morago ga moo la tlhokomelwa ka selwantsha-His sa konokono (mo sethibelong sa mH5l 1:1000 A190-114A, Dilaboratori tsa Bethyl, USA) diura di le 4. Morago ga go tlhatswa makgetlo a le 3 mo sethibelang-ditwatsi metsotso e le 5, lera le ne la kopanngwa le sethibela-ditwatsi sa bobedi se se lwantshanang le peba sa horseradish peroxidase (Sigma-Aldrich, UK) (se se tlhaolositsweng ka 1:10,000 mo sethibelang-dilwantsha-ditwatsi) W Incubate go letla go lemogwa (metsotso e le 5 morago ga go tlhatswa ga 3 mo sethibelang-ditwatsi sa chemistrate CESTAR0). (Cyanagen, Italy) le Setshwantsho sa Amersham 600 (Tlhokomelo ya Boitekanelo ya GE, UK).
Ka go thala kabo ya maatla a gel nngwe le nngwe e e nang le dithapo kgotsa mola wa immunoassay, go kopanya lefelo le le ka fa tlase ga tlhora le go bala selekanyo sa maatla a RC-L (gel e e nang le dithapo) le Protein-W (immunoassay), mo ImageJ (57) Dira setshwantsho. Ditekanyetso tseno di ne tsa fetolelwa go nna ditekanyetso tsa molar ka go tsaya gore tekanyetso ya RC-L go ya go poroteine-W mo sampoleng e e phepa ya RC-LH114-W e ne e le 1:1 le go tlwaetsa sete yotlhe ya tshedimosetso ka tshwanelo.
Go bona didirisiwa tsa tlaleletso tsa setlhogo seno, tsweetswee leba http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1.
Se ke setlhogo se se bulegileng se se anamisiwang ka fa tlase ga melawana ya Laesense ya Creative Commons ya go Tlhagisa. Setlhogo seno se letla gore se dirisiwe, se anamisiwe le go gatisiwa gape kwantle ga dithibelo ka tsela epe fela fa fela buka ya ntlhantlha e ka umakiwa sentle.
Ela tlhoko: Re go kopa fela gore o neele aterese ya gago ya imeile gore motho yo o mo akantshang mo tsebeng a itse gore o batla gore a bone imeile le gore ga se sepamo. Ga re na go tsaya diaterese dipe tsa imeile.
Potso eno e dirisiwa go leka gore a o moeng le go thibela thomelo ya sepamo ka go itirisa.
David J. K. Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M.
Sebopeho sa qeto e phahameng sa sebopeho sa serai sa lesedi 1 setsi sa karabelo se fana ka kutlwisiso e ntjha ka matla a quinone.
David J. K. Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M.
Sebopeho sa qeto e phahameng sa sebopeho sa serai sa lesedi 1 setsi sa karabelo se fana ka kutlwisiso e ntjha ka matla a quinone.
©2021 Mokgatlho wa Amerika wa Kgatelopele ya Saense. ditshwanelo tsotlhe di beilwe. AAAS ke molekane wa HINARI, AGORA, OARE, KHORASE, CLOCKSS, CrossRef le COUNTER. Dikgatelopele tsa Saense ISSN 2375-2548.