Ga jaana *Aterese ya ga jaana: Cologne 50931, Jeremane, Patlisiso ya Setlhopha sa Botswerere sa Cologne ka Tsibogo ya Kgatelelo ya Disele mo Malwetseng a a Amanang le Botsofe (CECAD).
Go senyega ga methapo ya malwetse a mitochondrial go tsewa go sa kgonege go busediwa morago ka gonne polasetiki ya metaboliki ya di-neuron e lekanyeditswe, mme phelelo ya go sa dire sentle ga di-mitochondria mo go ipuseng ga disele tsa metabolism ya di-neuron mo mmeleng ga e tlhaloganngwe sentle. Mona, re hlahisa proteome e itseng ya sele ya di-neuron tsa Purkinje tse nang le tlhaelo e tsoelang pele ya OXPHOS e bakilweng ke ho sitiswa ha matla a fusion ya mitochondrial. Re fitlhetse gore go sa dire sentle ga mitochondrial go ne ga dira gore go nne le phetogo e kgolo mo tirong ya di-proteomics, mme kgabagare seno sa dira gore mananeo a a tlhomameng a metaboliki a simolole go dira ka tatelano pele ga disele di swa. Re sa lebella, re ile ra etsa qeto ya ho kenngwa ho totobetseng ha pyruvate carboxylase (PCx) le di-peroxidase tse ding tse amanang le ho tlatsetsa di-media tsa potoloho ya TCA. Go thibelwa ga PCx go ne ga gakatsa kgatelelo ya oksijene le go senyega ga methapo, se se bontshang gore bolwetse jwa go koafala ga ditshika bo na le phelelo e e sireletsang mo disele tsa methapo tse di tlhaelang OXPHOS. Go tsosolosiwa ga go kopana ga di-mitochondria mo di- neuron tse di senyegileng thata go busetsa morago gotlhelele dinonofo tseno tsa metaboliki, ka jalo go thibela gore disele di se ka tsa swa. Diphitlhelelo tsa rona di supa ditsela tse di neng di sa itsiwe pele tse di nayang kgono ya go emelana le go sa dire sentle ga mitochondrial mme di bontsha gore go senyega ga methapo go ka busediwa morago le mo dikgatong tsa bofelo tsa bolwetse.
Seabe se se botlhokwa sa mitochondria mo go bolokeng phetogo ya maatla a disele tsa boboko se gatelelwa ke matshwao a a tseneletseng a methapo a a amanang le malwetse a batho a mitochondria. Bontsi jwa malwetse ano a bakwa ke diphetogo tsa dijini tse di laolang go tlhagisiwa ga dijini tsa mitochondrial (1, 2) kgotsa go senngwa ga dijini go go amanang le diphetogo tsa mitochondrial, tse di amang go tlhomama ga DNA ya mitochondrial (mtDNA) ka tsela e e sa tlhamalalang (3, 4). Tiro mo dikaong tsa diphologolo e bontshitse gore go tsibogela go sa dire sentle ga mitochondrial mo dithishung tse di di dikologileng, ditsela tsa metaboliki tse di sa fetogeng (5-7) di ka dirisiwa, ka jalo di neelana ka dintlha tsa botlhokwa ka ga pathogenesis ya malwetse ano a a raraaneng. Go farologana thata le seo, go tlhaloganya ga rona diphetogo tsa metaboliki tsa mefuta e e rileng ya disele tse di bakiwang ke go palelwa ka kakaretso ga go tlhagisa adenosine triphosphate (ATP) ya boboko ka kakaretso ke ga botlhokwa thata (8), go gatelela tlhokego ya go supa dintlha tsa kalafi tse di ka dirisiwang go thibela kgotsa go thibela malwetse. Thibela go senyega ga methapo (9). Go tlhoka tshedimosetso ke gore disele tsa methapo di tsewa ke botlhe di na le go fetofetoga le maemo go go lekanyeditsweng thata ga metaboliki fa di bapisiwa le mefuta ya disele tsa dithishu tse di di dikologileng (10). Ka ntlha ya gore disele tseno di na le seabe se se botlhokwa mo go gokaganyeng tlamelo ya di-metabolites go di-neuron go rotloetsa phetiso ya synaptic le go tsibogela maemo a kgobalo le malwetse, bokgoni jwa go fetola metabolism ya disele mo maemong a a gwetlhang a dithishu tsa boboko bo batla bo lekanyeditswe go disele tsa glial (11-14). Ho phaella moo, tlhaho sele heterogeneity ya boko dinama tse nyenyane tse haholo thibela thuto ya diphetoho metaboliki hore etsahala ka itseng neuronal dihlopha tse nyenyane. Ka ntlha ya moo, ga go itsiwe go le kalo ka ditlamorago tse di tlhomameng tsa go sa dire sentle ga di-mitochondria mo di-neuron tsa disele le tsa metaboliki.
Gore re kgone go tlhaloganya ditlamorago tsa metaboliki tsa go sa dire sentle ga mitochondrial, re ne ra kgaoganya di-neuron tsa Purkinje (PNs) mo dikgatong tse di farologaneng tsa go senyega ga methapo e e bakiwang ke go senngwa ga go kopana ga lera la kwa ntle la mitochondrial (Mfn2). Le fa diphetogo tsa Mfn2 mo bathong di amana le mofuta wa bolwetse jwa methapo ya dikutlo tsa dikoloi jo bo tsewang e le mofuta wa Charcot-Marie-Tooth wa 2A (15), go senngwa ga Mfn2 mo dipebeng ke go tsenngwa ga go sa dire sentle ga oksijene (OXthoPHOS). Mefuta e e farologaneng ya disele tsa boboko (16-19) le mofuta o o tlholang wa go senyega ga methapo di tsamaya le matshwao a a tswelelang pele a methapo, a a tshwanang le mathata a go tsamaya (18, 19) kgotsa cerebellar ataxia (16). Ka go dirisa motswako wa diproteomics tsa bontsi jo bo senang letshwao (LFQ), metabolomics, ditshwantsho, le mekgwa ya go senyega ga megare, re bontsha gore go senyega ga methapo go go tswelelang pele go tlhotlheletsa thata pyruvate carboxylase (PCx) le mabaka a mangwe a a amegang mo go nneng teng ga di-PN mo vivo Go tlhagisiwa ga di-enzyme. Go netefatsa botlhokwa jwa phitlhelelo eno, re ne ra fokotsa ka tlhamalalo go tlhagisiwa ga PCx mo di-PN tse di tlhaelang Mfn2, mme ra fitlhela gore tiro eno e ne ya gakatsa kgatelelo ya oxidative le go potlakisa go senyega ga methapo, ka jalo go supa gore azoospermia e dira gore disele di kgone go fetoga. Polelo e e masisi ya MFN2 e ka pholosa ka botlalo PN e e senyegileng e e nang le tlhaelo e e masisi ya OXPHOS, tiriso e kgolo ya DNA ya mitochondrial, le mafaratlhatlha a mitochondrial a a thubegileng, e leng se se gatelelang gape gore mofuta ono wa go senyega ga methapo o ka fola mo kgatong e e tsweletseng ya bolwetse jwa sele ya.
Gore re kgone go bona ka leitlho la mogopolo di-mitochondria mo di-PN tsa Mfn2, re ne ra dirisa mofuta wa peba o o letlang di-mitochondria tse di ikaegileng ka Cre go lebisa mo poroteineng e e serolwana ya fluorescent (YFP) (mtYFP) (20) Cre mme ra tlhola popego ya di-mitochondria mo vivo. Re fitlhetse gore go senngwa ga jini ya Mfn2 mo di-PN go ne go tla dira gore mafaratlhatlha a mitochondrial a kgaogane ka iketlo (Setshwantsho S1A), mme phetogo ya ntlha e ne ya fitlhelwa fa e le dibeke di le 3. Go farologana le seo, go senyega go go bonalang ga lera la sele ya PN, jaaka go supilwe ke go latlhegelwa ke Calbindin immunostaining, ga go a simolola go fitlha a le dibeke di le 12 (Setshwantsho 1, A le B). Go sa tshwane ga nako fa gare ga diphetogo tsa ntlhantlha tsa popego ya di-mitochondria le go simolola go go bonalang ga loso lwa di-neuron go ne ga re tlhotlheletsa go batlisisa diphetogo tsa metaboliki tse di bakiwang ke go sa dire sentle ga di-mitochondria pele ga loso lwa disele. Re ne ra tlhama leano le le theilweng mo go tlhaoleng disele tse di dirisiwang ke fluorescence (FACS) go kgaoganya PN e e tlhagisang YFP (YFP +) (Setshwantsho 1C), le mo dipebeng tsa taolo (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre), e morago ga fano e bidiwang CT1BRL (Setshwantsho). Go tokafatsa leano la go tsenya dikgoro go go ikaegileng ka maatla a a amanang le letshwao la YFP go re letla go phepafatsa mmele wa YFP + (YFPhigh) wa di-PN go tswa mo di-PN tse e seng tsa PN (YFPneg) (Setshwantsho S1B) kgotsa dikarolwana tsa axon/dendritic tsa fluorescent tse di akanngwang (YFPlow; Setshwantsho S1D, conforified ke molema). Gore re kgone go netefatsa boitshupo jwa baagi ba ba tlhaotsweng, re ne ra dira LFQ proteomics mme morago ga moo ra sekaseka karolo e kgolo, mme ra fitlhela gore go na le karogano e e bonalang sentle fa gare ga disele tsa YFPhigh le YFPneg (Setshwantsho S1C). Disele tsa YFPhigh di bontshitse go humisa ga nete ga ditshwai tsa PNs tse di itsegeng (ke gore Calb1, Pcp2, Grid2 le Itpr3) (21, 22), mme ga go na go humisa ga diporoteine ​​tse di tlwaelegileng go tlhagisiwa mo di-neuron kgotsa mefuta e mengwe ya disele (Setshwantsho 1D) ). Papiso magareng ga disampole mo diseleng tsa YFPhigh tse di tlhaotsweng tse di kokoantsweng mo ditekong tse di ikemetseng e bontshitse segokanyipalo sa kgolagano> 0.9, se se bontshang go kgona go tsala gape magareng ga dipoeletso tsa ditshedi (Setshwantsho S1E). Ka bokhutshwane, tshedimosetso eno e ne ya netefatsa leano la rona la go itlhaola ka bogale le go go rileng ga PN e e kgonegang. Hobane tsamaiso ya mokganni wa L7-cre e sebedisitsweng e hlohlelletsa ho kopanngwa hape ha mosaic bekeng ya pele kamora ho beleha (23), re ile ra qala ho bolaya dipeba ho tswa ho CTRL le maemo (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) Bokella di-neuron. Morago ga go kopanngwa gape go weditswe, e bidiwa Mfn2cKO fa e le dibeke di le 4. E le ntlha ya bofelo, re ne ra tlhopha dibeke di le 8 tsa dingwaga fa lera la PN le ne le santse le sa senyega le fa go ne go na le dikarolwana tse di bonalang tsa mitochondrial (Setshwantsho 1B le Setshwantsho S1A). Ka kakaretso, re ne ra lekanya palogotlhe ya diporoteine ​​di le 3013, tse mo e ka nnang 22% ya tsone e neng e theilwe mo ditshwaelong tsa MitoCarta 2.0 tse di theilweng mo poroteomong ya mitochondria jaaka mitochondria (Setshwantsho 1E) (Setshwantsho 1E) (24). Tshekatsheko ya tlhagiso ya dijini tse di farologaneng e e dirilweng mo bekeng ya bo 8 e bontshitse gore ke fela 10.5% ya diporoteine ​​tsotlhe tse di neng di na le diphetogo tse di bonalang (Setshwantsho 1F le Setshwantsho S1F), tse mo go tsona diporoteine ​​di le 195 di neng di laolwa kwa tlase mme diporoteine ​​di le 120 di ne di laolwa kwa godimo (Setshwantsho 1F). Go botlhokwa go ela tlhoko gore “tshekatsheko ya tsela ya boitshimololedi” ya sete eno ya tshedimosetso e bontsha gore dijini tse di tlhagisitsweng ka go farologana ke tsa sete e e thibetsweng ya ditsela tse di rileng tsa metaboliki (Setshwantsho 1G). Se se kgatlhang ke gore, le fa go laolwa ga ditsela tse di amanang le OXPHOS le go ntsha matshwao a khalesiamo go tlhomamisa go tsenngwa ga go sa dire sentle ga mitochondrial mo di-PN tse di tlhaelang fusion, ditlhopha tse dingwe tse di akaretsang thata metabolism ya amino acid di laolwa thata, e leng se se tsamaelanang le metabolism ya mitochdrion P e e diragalang. Go tsenya megala gape go a tlhomama. go sa dire sentle.
(A) Dinepe tsa confocal tse di emelang tsa dikarolo tsa boboko tsa dipeba tsa CTRL le Mfn2cKO tse di bontshang tatlhegelo e e tswelelang pele ya di-PN (calbindin, e e pududu); dinyuklea di ne di tshwailwe ka DAPI. (B) Go lekanyetsa (A) (tshekatsheko ya tsela e le nngwe ya pharologano, *** P <0.001; n = 4 go ya go 6 didiko go tswa mo dipebeng tse tharo). (C) Kelelo ya tiro ya ditekelelo. (D) Kabo ya mmapa wa mogote wa batshwai ba ba rileng ba Purkinje (kwa godimo) le mefuta e mengwe ya disele (bogare). (E) Setshwantsho sa Venn se se bontshang palo ya diporoteine ​​tsa mitochondrial tse di supilweng mo PN e e tlhaotsweng. (F) Poloto ya lekgwamolelo ya diporoteine ​​tse di tlhagisitsweng ka go farologana mo di-neuron tsa Mfn2cKO ka dibeke di le 8 (boleng jwa go kgaola jwa botlhokwa jwa 1.3). (G) Tshekatsheko ya tsela ya boitlhamedi e bontsha ditsela tse tlhano tse di botlhokwa thata tsa go laola kwa godimo (bohibidu) le go laola kwa tlase (botala jwa loapi) mo Mfn2cKO PN e e tlhaotsweng jaaka dibeke di le 8. Palogare ya maemo a tlhagiso ya poroteine ​​nngwe le nngwe e e lemogilweng e a bontshiwa. Mmapa wa mogote wa Grayscale: boleng jwa P jo bo fetotsweng. ns, ga se botlhokwa.
Dintlha tsa proteomics di bontshitse gore go tlhagisiwa ga diporoteine ​​tsa di-complex I, III le IV go ne ga fokotsega ka iketlo. Di-complex I, III, le IV tsotlhe di ne di na le diyunitipotlana tse di botlhokwa tse di tsenngwang khoutu ya mtDNA, fa complex II, e e neng e tsentswe dikhoutu tsa nyutlea fela, e ne e sa amege (Setshwantsho 2A le Setshwantsho S2A). . Go tsamaisana le dipholo tsa proteomics, immunohistochemistry ya dikarolo tsa dithishu tsa boboko e bontshitse gore MTCO1 (yuniti e nnye ya cytochrome C oxidase 1) ya yuniti e nnye ya IV e e raraaneng mo PN e ne ya fokotsega ka iketlo (Setshwantsho 2B). Yuniti e nnye e e tsenngwang khoutu ya mtDNA Mtatp8 e ne ya fokodiwa thata (Setshwantsho S2A), fa maemo a a tlhomameng a yuniti e nnye ya ATP synthase e e tsenngwang khoutu ya nyutlea e ne ya nna e sa fetoge, e leng se se tsamaelanang le sebopego se se tlhomameng sa ATP synthase sa F1 se se itsegeng se se tlhomameng fa polelo ya mtDNA e tlhomame. Sebopego se a tlhomama. Kgaotsa (7). Tekolo ya maemo a mtDNA mo di-PN tsa Mfn2cKO tse di tlhophilweng ka tsibogo ya ketane ya polymerase ya nako ya nnete (qPCR) e netefaditse phokotsego ya palo ya dikhopi tsa mtDNA ka iketlo. Fa go bapisiwa le setlhopha sa taolo, ka dibeke di le 8, ke fela bokana ka 20% ya selekanyo sa mtDNA se se neng sa bolokwa (Setshwantsho 2C). Go tsamaelana le dipholo tseno, go tshasiwa ga di-PN tsa Mfn2cKO ka maekerosekopo ya confocal go lemoga DNA go bontsha tiriso e e ikaegileng ka nako ya dinyukleotide tsa mitochondrial (Setshwantsho 2D). Re fitlhetse gore ke fela bontlhopheng bangwe ba ba amegang mo go senyegeng ga poroteine ​​ya mitochondrial le karabelo ya kgatelelo ya maikutlo ba ba neng ba laolwa, go akaretsa le Lonp1, Afg3l2 le Clpx, le mabaka a a raraaneng a go kopanya OXPHOS. Ga go na diphetogo tse di botlhokwa mo maemong a diporoteine ​​tse di amegang mo apoptosis tse di lemogilweng (Setshwantsho S2B). Fela jalo, re fitlhetse gore ditšhanele tsa mitochondria le tsa endoplasmic reticulum tse di amegang mo dipalangweng tsa khalesiamo di na le diphetogo tse dinnye fela (Setshwantsho S2C). Ho phaella moo, tlhahlobo ya diprotheine tse amanang le autophagy ha e a fumana diphetoho tse kgolo, tse dumellanang le ho kenngwa ho bonahalang ha di-autophagosome tse lemohilweng ka vivo ka immunohistochemistry le maekerosekopo ya elektroniki (Setshwantsho S3). Le fa go ntse jalo, go sa dire sentle ga OXPHOS mo di-PN go tsamaya le diphetogo tse di bonalang sentle tsa mitochondrial. Ditlhopha tsa mitochondrial di ka bonwa mo mebeleng ya disele le mo ditlhareng tsa dendritic tsa di-PN tsa Mfn2cKO tse di nang le dibeke di le 5 le 8, mme popego ya lera la ka fa gare e nnile le diphetogo tse di tseneletseng (Setshwantsho S4, A le B). Go tsamaisana le diphetogo tseno tsa popego e e kwa godimo le phokotsego e e bonalang ya mtDNA, tshekatsheko ya diselaese tsa boboko jo bo bogale tse di nang le tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM) e bontshitse gore bokgoni jwa lera la mitochondrial mo di-PN tsa Mfn2cKO bo ne jwa fokotsega thata (Setshwantsho S4C).
(A) Nako thulaganyo tshekatsheko ya polelo boemo ba OXPHOS rarahaneng. Akanyetsa fela diporoteine ​​tse di nang le P<0.05 mo dibekeng tse 8 (ANOVA ya ditsela tse pedi). Mola o o marontho: Ga go na paakanyo fa e bapisiwa le CTRL. (B) Ka fa molemeng: Sekao sa karolo ya cerebellar e e tshwailweng ka selwantsha-MTCO1 (bara ya sekale, 20 μm). Lefelo le le tserweng ke ditopo tsa disele tsa Purkinje le khurumeditswe ke mmala o mosetlha. Ka fa mojeng: Go lekanyetsa maemo a MTCO1 (tshekatsheko ya pharologano ya tsela e le nngwe; n = disele di le 7 go ya go di le 20 tse di sekasekilweng go tswa mo dipebeng di le tharo). (C) qPCR tshekatsheko ya mtDNA khopi nomoro ka hlophisitsweng PN (tsela e le 'ngoe tshekatsheko ya phapang; n = 3 ho 7 litoeba). (D) Ka fa molemeng: Sekao sa selae sa cerebellar se se tshwailweng ka selwantsha-DNA (bara ya sekale, 20 μm). Lefelo le le tserweng ke ditopo tsa disele tsa Purkinje le khurumeditswe ke mmala o mosetlha. Ka fa mojeng: Go lekanyetsa dintho tsa mtDNA (tshekatsheko ya pharologano ya tsela e le nngwe; n = disele di le 5 go ya go di le 9 go tswa mo dipebeng di le tharo). (E) Sekao sa karolo e e bogale ya cerebellar e e bontshang disele tsa mitoYFP + Purkinje (motsu) mo rekotong ya tlelampe ya patch ya sele yotlhe. (F) Go lekanyetsa sebopego sa IV. (G) Dikgatiso tsa baemedi tsa go tlhabelwa ga jaanong go ntsha dipolari mo diseleng tsa CTRL le Mfn2cKO Purkinje. Top trace: Pulse ya ntlha e e neng ya tsosa AP. Motlhala o o kwa tlase: Makgetlo a a kwa godimo a AP. (H) Go lekanyetsa ditlhagiso tsa morago ga synaptic tse di itiragalelang fela (sPSPs). Motlhala wa go rekota o o emelang le selekanyo sa yone sa go atolosa di bontshiwa mo go (I). Tshekatsheko ya tsela e le nngwe ya pharologano e ne ya sekaseka disele tsa n = 5 go ya go di le 20 go tswa mo dipebeng tse tharo. Tshedimosetso e tlhagisiwa jaaka palogare ± SEM; *P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001. (J) Moemedi metlhala ya AP e e itlhagetseng e e kwadilweng ka go dirisa mokgwa wa tlelampe ya patch e e phunyeleditsweng. Motlhala o o kwa godimo: Makgetlo a a kwa godimo a AP. Motlhala o o kwa tlase: zoom ya AP e le nngwe. (K) Lekanyetsa palogare le bogolo jwa makhubu a AP go ya ka (J). Teko ya Mann-Whitney; n = 5 disele di ne tsa sekasekwa go tswa mo dipebeng tse nne. Tshedimosetso e tlhagisiwa jaaka palogare ± SEM; ga se botlhokwa.
Tshenyo e e bonalang ya OXPHOS e ne ya lemogiwa mo Mfn2cKO PN ya dibeke di le 8, e e supang gore tiro ya mmele ya di-neuron ga e a tlwaelega thata. Ka lebaka leo, re ile ra sekaseka dipharologantsho tsa motlakase tse di sa direng sepe tsa di-neuron tse di tlhaelang OXPHOS ka dibeke di le 4 go ya go di le 5 le dibeke di le 7 go ya go di le 8 ka go dira dikgatiso tsa patch clamp ya disele tsotlhe mo diselaese tse di bogale tsa cerebellar (Setshwantsho 2E). Ka go sa lebelelwa, palogare ya bokgoni jwa lera la go ikhutsa le go emelana le go tsenya ga di-neuron tsa Mfn2cKO di ne di tshwana le taolo, le fa go ne go na le dipharologano tse di sa bonaleng fa gare ga disele (Table 1). Fela jalo, ka dibeke di le 4 go ya go di le 5, ga go a fitlhelwa diphetogo tse di bonalang mo kamanong ya motlakase-motlakase (IV curve) (Setshwantsho 2F). Le fa go ntse jalo, ga go na di-neuron tsa Mfn2cKO tsa dibeke di le 7 go ya go di le 8 tse di neng tsa falola thulaganyo ya IV (kgato ya hyperpolarization), se se bontshang gore go na le go nna bosisi go go bonalang sentle mo bokgoning jwa go nna le hyperpolarization mo kgatong eno ya morago ga nako. Ho fapana le hoo, di-neuron tsa Mfn2cKO, metsi a depolarizing a bakang ho ntsha ha bokgoni ba ketso e pheta-phetang (AP) a mamelleha hantle, ho bontsha hore mekgwa ya bona ya ho ntsha ka kakaretso ha e fapane haholo le ya di-neuron tsa taolo tsa dibeke tse 8 (Lenaneo 1 le Setshwantsho sa 2G). Fela jalo, makgetlo le bogolo jwa makhubu a a itiragalelang a postsynaptic (sPSCs) a ne a bapisiwa le a setlhopha sa taolo, mme makgetlo a ditiragalo a ne a oketsega go tswa go dibeke di le 4 go ya go dibeke di le 5 go ya go dibeke di le 7 go ya go dibeke di le 8 ka koketsego e e tshwanang (Setshwantsho 2, H le I). Paka ya go butswa ga synaptic mo di-PN (25). Dipholo tse di tshwanang di ne tsa bonwa morago ga dipetšhe tsa PNs tse di phunyeleditsweng. Thulaganyo eno e thibela pusetso e e ka nnang teng ya diphoso tsa ATP tsa disele, jaaka go ka direga mo go rekoteng ga tlelampe ya patch ya disele tsotlhe. Ka ho khetheha, le phomolo lera bokgoni le itlhahelang thunya maqhubu a Mfn2cKO neurons ba ne ba sa ameha (Setshwantsho 2, J le K). Ka bokhutshwane, dipholo tseno di supa gore di-PN tse di nang le go sa dire sentle ga OXPHOS go go bonalang di ka kgona go lepalepana le diphethene tsa go ntsha makhubu a a kwa godimo sentle, se se supang gore go na le mokgwa wa pusetso o o di letlang go boloka dikarabo tse di gaufi le tse di tlwaelegileng tsa electrophysiological.
Tshedimosetso e tlhagisiwa jaaka palogare ± SEM (tshekatsheko ya tsela e le nngwe ya pharologano, teko ya papiso ya Holm-Sidak ya bontsi; * P <0.05). Nomoro ya yuniti e bontshitswe ke masaka.
Re ne ra tlhoma go batlisisa gore a setlhopha sepe mo setlhopheng sa tshedimosetso sa proteomics (Setshwantsho 1G) se akaretsa ditsela tse di ka lwantshanang le tlhaelo e e masisi ya OXPHOS, ka jalo re tlhalosa gore ke ka ntlha yang fa PN e e amegang e ka boloka electrophysiology e e gaufi le e e tlwaelegileng (Setshwantsho 2, E go ya go K). . Tshekatsheko ya proteomics e bontshitse gore diensaeme tse di amegang mo go fetoleng diaminoesiti tsa ketane e e nang le dikala (BCAA) di ne di laolwa thata (Setshwantsho 3A le Setshwantsho S5A), mme setlhagiswa sa bofelo sa acetyl-CoA (CoA) kgotsa succinyl CoA se ka tlaleletsa di-tricarboxylate mo bolwetseng jwa go koafala ga ditshika. Re fitlhetse gore diteng tsa BCAA 1 (BCAT1) le BCAT2 ka bobedi di ne tsa oketsega. Ba ne ba tlhotlheletsa kgato ya ntlha ya go fetoga ga BCAA ka go tlhagisa glutamate go tswa mo α-ketoglutarate (26). Diyunitipotlana tsotlhe tse di bopang ketane e e nang le makala ya keto acid dehydrogenase (BCKD) e e raraaneng di a laolwa (motswako o o raraaneng o tlhotlheletsa decarboxylation e e latelang le e e ka se busediweng morago ya lerapo la khabone la BCAA le le tlholang) (Setshwantsho 3A le Setshwantsho S5A). Le fa go ntse jalo, ga go na diphetogo tse di bonalang mo BCAA ka boyona tse di fitlhetsweng mo PN e e tlhophilweng, e e ka tswang e le ka ntlha ya go tsewa go go oketsegileng ga disele tsa diaminoesiti tseno tsa botlhokwa kgotsa tiriso ya metswedi e mengwe (glucose kgotsa lactic acid) go tlaleletsa modikologo wa TCA (Setshwantsho S5B). Di-PN tse di tlhokang OXPHOS le tsone di bontshitse ditiro tse di oketsegileng tsa go bola ga glutamine le go fetisiwa ga tsone mo dibekeng tse 8, tse di ka bontshiwang ke go laolwa ga diensaeme tsa mitochondrial tsa glutaminase (GLS) le glutamine pyruvate transaminase 2 (GPT2) (Setshwantsho 3, A le C). Ke habohlokoa ho hlokomela hore ho fihlela-taolo ya GLS e lekanyeditswe ho isoform glutaminase C (GLS-GAC) e kopantsweng (phetoho ya Mfn2cKO / CTRL e ka bang 4.5-mena, P = 0.05), mme taolo ya yona e itseng ya ho fihlela dithishung tsa kankere E ka tshehetsa mitochnergyondrial. (27).
(A) Mmapa wa mogote o bontsha phetogo ya menagano ya selekanyo sa poroteine ​​sa tsela e e beilweng mo dibekeng tse 8. (B) Sekao sa selae sa cerebellar se se tshwailweng ka selwantsha-PCx (bara ya sekale, 20 μm). Motsu o mosetlha o supa mmele wa sele ya Purkinje. (C) Tshekatsheko ya tlhagiso ya poroteine ​​ya nako e e supilweng jaaka ntlhopheng wa botlhokwa wa bolwetse jwa go koafala ga ditshika (teko ya t e ntsi, * FDR <5%; n = 3-5 dipeba). (D) Fa godimo: Setshwantsho sa sekema se se bontshang ditsela tse di farologaneng tsa go tsenya khabone e e tshwailweng e e mo [1-13C]pyruvate tracer (ke gore, ka PDH kgotsa ka tsela ya go feta mo ditshikeng). Kwa tlase: Tšhate ya sebintšolo e bontsha phesente ya khabone e e tshwailweng e le nngwe (M1) e e fetoletsweng go nna esiti ya aspartic, esiti ya citric le esiti ya malic morago ga go tshwaya diselaese tse di bogale tsa boboko ka [1-13C]pyruvate (teko ya t e e kopantsweng; ** P <0.01). (E) Tshekatsheko e e tseneletseng ya hisitori ya nako ya tsela e e supilweng. Akanyetsa fela diporoteine ​​tse di nang le P<0.05 mo dibekeng tse 8 . Mola o o thaladitsweng: ga go na boleng jwa paakanyo (tshekatsheko ya ditsela tse pedi ya pharologano; * P <0.05; *** P <0.001). Tshedimosetso e tlhagisiwa jaaka palogare ± SEM.
Mo tshekatshekong ya rona, BCAA catabolism e fetogile nngwe ya ditsela tse di botlhokwa tsa go laola. Ntlha e e akantsha thata gore bolumu ya mowa e e tsenang mo modikologong wa TCA e ka fetolwa mo PN e e tlhaelang OXPHOS. Seno se ka emela mofuta o mogolo wa go tsenngwa gape ga dithapo tsa metaboliki ya disele tsa boboko, tse di ka nnang le tlhotlheletso e e tlhamaletseng mo fisiolojing ya disele tsa boboko le go falola ka nako ya go tlhokomela go sa dire sentle ga OXPHOS go go masisi. Go dumalana le kgopolo eno, re fitlhetse gore enzyme e kgolo e e lwantshang go thatafala ga ditshika PCx e laolwa ka tsela e e kwa godimo (Mfn2cKO/CTRL e fetoga mo e ka nnang makgetlo a le 1,5; Setshwantsho 3A), e e dirang gore pyruvate e fetoge go nna oxaloacetate (28), e go dumelwa gore e mo bra, 30). Go tsamaisana le dipholo tsa proteomics, maekerosekopo ya confocal e bontshitse gore polelo ya PCx e ne e oketsegile ka tlhamalalo le thata mo di-PN tse di tlhaelang OXPHOS, fa tsibogo ya PCx e ne e lekanyeditswe thata mo diseleng tse di bapileng tsa Bergmann glial tsa taolo (Setshwantsho 3B). Go leka ka tsela e e dirang go tlhatlosiwa ga PCx go go lemogilweng, re ne ra alafa diselaese tse di bogale tsa boboko ka [1-13C] pyruvate tracer. Fa pyruvate e ne e oksidiwa ke pyruvate dehydrogenase (PDH), letshwao la yone la isotope le ne la nyelela , Mme le tsenngwa mo dilong tse di fa gare tsa modikologo wa TCA fa pyruvate e fetolwa ke diphetogo tsa methapo (Setshwantsho 3D). Go tshegetsa tshedimosetso ya rona ya proteomics, re ne ra lemoga palo e ntsi ya batshwai go tswa mo molateding ono mo esiting ya aspartic ya diselaese tsa Mfn2cKO, fa esiti ya citric le esiti ya malic le tsone di ne di na le tlwaelo e e magareng, le fa e se botlhokwa (Setshwantsho 3D).
Mo di-neuron tsa dopamine tsa dipeba tsa MitoPark tse di nang le go sa dire sentle ga di-mitochondria go go bakiwang ke di-neuron tsa dopamine tse di senyang ka tlhamalalo jini ya ntlha ya go kwalolola ya mitochondrial A (Tfam) (Setshwantsho S6B), go tlhagisiwa ga PCx le gone go ne go laolwa thata (31), go bontsha gore go sa dire sentle ga asiti ya acetone go dira gore go nne le bolwetse jwa go koafala ga ditshika. OXPHOS mo mmeleng. Go botlhokwa go ela tlhoko gore go fitlhetswe gore diensaeme tse di kgethegileng (32-34) tse di ka tlhagisiwang mo dinyuroneng tse di ka tswang di amana le bolwetse jwa go koafala ga ditshika di laolwa thata mo di-PN tse di tlhaelang OXPHOS, tse di jaaka propionyl-CoA carboxylase (PCC-A), Malonyl-CoA e e fetolelang propionyl-CoA go nna . ensaeme 3 (ME3), e seabe sa yona se segolo e leng go busetsa pyruvate mo malateng (Setshwantsho 3, A le C) (33, 35). Mo godimo ga moo, re ne ra fitlhela koketsego e e bonalang ya enzyme ya Pdk3, e e phosphorylate mme ka jalo e dira gore PDH e se ka ya dira (36), fa go ne go sa lemogiwe diphetogo dipe mo enzymeng ya Pdp1 e e dirang gore PDH e dire kgotsa mo setlhopheng sa enzyme ya PDH ka boyone (Setshwantsho 3A). Ka go tlhomama, mo di-PN tsa Mern2cKO, phosphorylation ya yuniti e nnye ya α1 (PDHE1α) ya karolo ya pyruvate dehydrogenase E1 ya PDH e e raraaneng mo Ser293 (e e itsiweng go thibela tiro ya enzyme ya PDH) e ne ya tokafadiwa ( Setshwantsho S6C) ( Setshwantsho S6C). Pyruvate ga e na phitlhelelo ya methapo.
Kwa bofelong, re ne ra fitlhela gore tsela e e kwa godimo ya go tlhama ditshedi tsa serine le glycine, modikologo o o amanang le mitochondrial folate (1C) le go tlhama ga ditshedi tsa proline (Setshwantsho 1G le Setshwantsho S5C) tsotlhe di laolwa ka tsela e e botlhokwa, go ya ka dipegelo, ka nako ya thulaganyo ya go dira gore di dire. The dinama tse nyenyane tse pota-potileng di butswe le mitochondrial ho se sebetse (5-7). Tshekatsheko ya confocal e e tshegetsang tshedimosetso eno ya diporoteine ​​e bontshitse gore mo PN e e nang le OXPHOS e e tlhaelang, diselaese tsa boboko jwa dipeba tsa dibeke di le 8 di ne tsa tsenngwa mo serine hydroxymethyltransferase 2 (SHMT2), e leng ensaeme ya botlhokwa ya modikologo wa folate ya mitochondrial. Karabelo e e botlhokwa ya masole a mmele (Setshwantsho S5D). Mo diselaeseng di le 13 tsa cerebellar tse di bogale tse di tlhotlheleditsweng ka sukiri, diteko tsa go latedisa metaboliki di ne tsa tlhomamisa gape go laolwa ga biosynthesis ya serine le proline, go supa gore go elela ga di-isoform tsa khabone go nna serine le proline go ne ga oketsega (Setshwantsho S5E). Ka gonne dikarabelo tse di rotloediwang ke GLS le GPT2 di na le boikarabelo jwa go tlhakanya glutamate go tswa mo glutamine le go fetolwa ga glutamate le α-ketoglutarate, go laolwa ga tsone go bontsha gore di-neuron tse di tlhaelang OXPHOS di na le tlhokego e e oketsegileng ya glutamate , Seno se ka tswa se ikaeletse go boloka biosynthesis e e oketsegileng ya proureline (Setshwantsho5). Ho fapana le diphetoho tsena, tlhahlobo ya proteomic ya di-astrocyte tsa cerebellar ho tswa ho dipeba tsa Mfn2cKO tse ikgethileng tsa PN e bontshitse hore ditsela tsena (ho kenyeletswa le di-antiperoxidases tsohle) ha di a fetoha haholo ka polelo, kahoo di bontsha hore phetoho ena ya metaboliki e kgetha ho PN e senyehileng ho D ho G, Setshwantsho sa S6).
Ka bokhutshwane, ditshekatsheko tseno di senotse mekgwa e e farologaneng thata ya go dira ga ditsela tse di rileng tsa metaboliki mo di-PN. Le fa tiro e e sa tlwaelegang ya mitochondrial ya disele tsa boboko e ka baka go koafala ga ditshika tsa madi go sa le gale le go bopiwa sešwa ga 1C (Setshwantsho 3E le Setshwantsho S5C), le diphetogo tse di ka bonelwang pele mo go tlhagiseng dikarolo tsa I le IV, diphetogo mo tlhakanyong ya serine de novo ke fela E ne ya bonala fela mo dingwageng tsa bofelo. OXPHOS go sa dire sentle (Setshwantsho 3E le Setshwantsho S5C). Diphitlhelelo tseno di tlhalosa thulaganyo e e latelanang e mo go yone mitochondrial (modikologo wa 1C) le cytoplasmic (biosynthesis ya serine) e e bakiwang ke kgatelelo ya maikutlo di tsibogelang ka tirisanommogo le koketsego ya go koafala ga ditshika mo modikologong wa TCA go bopa sešwa metabolism ya disele tsa boboko.
Di-PN tse di tlhaelang OXPHOS tsa dibeke di le 8 di ka boloka tiro ya go tsosa makgetlo a a kwa godimo mme tsa nna le kgolagano e e botlhokwa ya metaboliki go duelela go sa dire sentle ga mitochondrial. Thibololo eno e tsosa kgonagalo e e kgatlhang ya gore le mo nakong eno, disele tseno le tsone di ka nna tsa Amogela thuso ya kalafi go diegisa kgotsa go thibela go senyega ga methapo. Thari. Re rarabolotse kgonagalo e ka ditsereganyo tse pedi tse di ikemetseng. Mo mokgweng wa ntlha, re ne ra tlhama vector e e amanang le adeno e e ikaegileng ka Cre (AAV) gore MFN2 e kgone go tlhagisiwa ka go tlhopha mo di-PN tse di tlhaelang OXPHOS mo vivo (Setshwantsho S7A). AAV e e tsenyang khoutu ya MFN2 le jini ya mmegadikgang ya fluorescent mCherry (Mfn2-AAV) di ne tsa netefadiwa mo ditso tsa di-neuron tsa konokono mo vitro, e leng se se neng sa dira gore MFN2 e tlhagisiwe ka mokgwa o o ikaegileng ka Cre mme ya pholosa popego ya mitochondrial, ka jalo ya thibela phetogo ya di-neuron mo Mfns D, E Setshwantsho S2c7). Latelang, re ile ra etsa diteko tsa vivo ho stereotactically tlisa Mfn2-AAV ya dibeke tse 8 ho cerebellar cortex ya Mfn2cKO le dipeba tsa taolo, mme ra sekaseka dipeba tsa dibeke tse 12 (Setshwantsho 4A). Dipeba tsa Mfn2cKO tse di alafilweng di ne tsa swa (Setshwantsho 1, A le B) (16). Phetiso ya vaerase ka vivo e ile ya fella ka polelo e kgethehileng ya PN didikadikweng tse ding tsa cerebellar (Setshwantsho S7, G le H). Go tlhabelwa ga AAV ya taolo e e tlhagisang mCherry fela (Ctrl-AAV) ga go a ka ga nna le ditlamorago tse di bonalang mo selekanyong sa go senyega ga methapo mo diphologolong tsa Mfn2cKO. Ho fapana le hoo, tlhahlobo ya Mfn2cKOs e fetotsweng ka Mfn2-AAV e bontshitse phello e bohlokwa ya tshireletso ya lera la sele ya PN (Setshwantsho 4, B le C). Segolobogolo, kitlano ya di-neuron e lebega e batla e sa farologanngwe le diphologolo tsa taolo (Setshwantsho 4, B le C, le Setshwantsho S7, H le I). Polelo ya MFN1 mme e seng MFN2 e atlega ka go lekana mo go bolokeng loso lwa disele tsa boboko (Setshwantsho 4C le Setshwantsho S7, C le F), se se supang gore polelo ya ectopic MFN1 e ka tlaleletsa ka katlego go tlhoka MFN2. Tshekatsheko e nngwe mo maemong a le nosi a PN e ne ya bontsha gore Mfn2-AAV e ne ya namola thata sebopego sa mitochondria, ya dira gore maemo a mtDNA a tlwaelege, mme ya busetsa morago go tlhagisiwa go go kwa godimo ga letshwao la PCx le le kgatlhanong le angiogenesis (Setshwantsho 4, C go ya go E ). Tlhatlhobo ya pono ya dipeba tsa Mfn2cKO tse di pholositsweng mo seemong sa go ikhutsa e bontshitse gore go ema ga tsone le matshwao a go tsamaya (go tsamaya S1 go ya go S3) go ne ga tokafala. Ka go konela, diteko tseno di bontsha gore go tsenngwa gape ga MFN2 mo di-PN tse di tlhaelang thata mo OXPHOS go diegile go lekane go busetsa morago tiriso ya mtDNA le go tlhotlheletsa go koafala ga ditshika, ka jalo go thibela go senyega ga axon le loso lwa disele tsa boboko mo vivo.
(A) Sekema se se bontshang thulaganyo ya diteko tsa go tlhaba AAV e e tsenyang khoutu ya MFN2 fa tsela e e supilweng ya metaboliki e dirisiwa. (B) Dinepe tsa confocal tse di emelang dikarolo tsa cerebellar tsa dibeke di le 12 tse di fetotsweng ka dipeba tsa Mfn2cKO mo dibekeng tse 8 mme di tshwailwe ka selwantsha-Calbindin. Ka fa mojeng: Go sekaseka ga ditlhale tsa axon. Sekala sa zoom ya axon ke 450 le 75 μm. (C) Ka fa molemeng: Go lekanyetsa kitlano ya disele tsa Purkinje mo lupung ya phetolelo ya AAV (AAV +) (tshekatsheko ya tsela e le nngwe ya pharologano; n = 3 dipeba). Ka fa mojeng: tshekatsheko ya tsepamiso ya mtDNA mo PN e e fetotsweng mo bekeng ya 12 (t-test e e sa kopaneng; n = 6 disele go tswa mo dipebeng tse tharo). * P <0,05; ** P <0.01. (D) Di-micrograph tsa eleketeroniki tsa phetiso ya di-PN tsa dikarolo tsa cerebellar tsa Mfn2cKO tse di fetotsweng ka di-vector tsa megare tse di supilweng. Mask o o pinki o bontsha lefelo le le tserweng ke di-dendrite, mme sekwere se se serolwana se se nang le marontho se bontsha zoom e e neetsweng ka fa mojeng; n e emela nyutlease. Bara ya sekale, 1μm. (E) e bontsha sekai sa go tshasiwa ga PCx mo PN e e fetotsweng mo dibekeng tse 12. Bara ya sekale, 20μm. OE, go tlhagisa maikutlo go feta selekanyo; FC, phetogo ya mena.
Kwa bofelong, re ne ra batlisisa botlhokwa jwa go falola ga disele tse di tlhotlhelediwang ke peroxidase mo di-PN tse di itemogetseng go sa dire sentle ga OXPHOS. Re ne ra tlhagisa mCherry e e tsenyang khoutu ya AAV-shRNA (RNA e khutshwane ya moriri) e e neng e lebisitswe ka tlhamalalo mo mRNA ya PCx ya peba (AAV-shPCx), mme ra tlhaba mogare kgotsa taolo ya yone e e tlhakatlhakaneng (AAV-scr) mo bobokong jwa dipeba tsa Mfn2cKO. Ente e ne ya dirwa mo bekeng ya bone ya dingwaga (Setshwantsho 5A) go fitlhelela go kgaola ga PCx go go atlegileng mo pakeng e tlhagiso ya PCx e neng e oketsega (Setshwantsho 3C) mme lera la sele ya PN le ne le santse le sa senyega (Setshwantsho 1A). Go botlhokwa go ela tlhoko gore go diga PCx (Setshwantsho S8A) go isa kwa go potlakiseng go go bonalang ga loso lwa PN, e leng lone fela lesale le le thibetsweng la tshwaetsego (Setshwantsho 5, B le C). E le hore re utloisise mokgwa wa ditlamorao tsa metaboliki tse hlohlelleditsweng ke PCx ho fihlela-taolo, re ile ra ithuta boemo ba redox ba PNs ka mora PCx knockdown le AAV-tsereganang biosensor Grx1-roGFP2 ba ne ba hlahiswa ka nako e le nngwe (Setshwantsho S8, B ho D) ho hlahloba glutathione ya leloko). Go tswa foo, re ne ra dira maekerosekopo ya botshelo jotlhe ya fluorescence ya photon tse pedi (FLIM) mo dilae tse di bogale tsa boboko jwa Mfn2cKO ya dibeke di le 7 kgotsa di-littermates tsa taolo go lemoga diphetogo tse di ka nnang teng mo seemong sa cytoplasmic redox morago ga go netefatsa maemo a FLIM (Setshwantsho S8, E go ya go G). Tshekatsheko e bontshitse koketsego e e bonalang ya boemo jwa oksijene jwa PNs e le nngwe ya Mfn2cKO e e tlhaelang tlhagiso ya PCx, e e farologaneng le di-neuron tsa taolo kgotsa di-PNs tsa Mfn2cKO tse di tlhagisang fela shRNA e e tlhakantsweng (Setshwantsho 5, D le E). Fa polelo ya PCx e ne e laolwa ka fa tlase, peresente ya di-PN tsa Mfn2cKO tse di bontshang boemo jo bo nang le oksijene e e kwa godimo e ne ya oketsega ka makgetlo a a fetang a le mararo (Setshwantsho 5E), se se supang gore go laolwa ga PCx go ne ga boloka bokgoni jwa redox jwa di-neuron tse di senyegileng.
(A) Sekema se se bontshang thulaganyo ya diteko tsa go tlhaba AAV e e tsenyang khoutu ya shPCx fa tsela e e supilweng ya metaboliki e dirisiwa. (B) Dinepe tsa confocal tse di emelang dikarolo tsa cerebellar tsa dibeke di le 8 mo dipebeng tsa Mfn2cKO tse di fetotsweng le go tshwaiwa ka selwantsha-calcineurin mo dibekeng tse 4. Bara ya sekale, 450μm. (C) Go lekanyetsa kitlano ya disele tsa Purkinje mo di-loop tse di fetotsweng ke AAV (tshekatsheko ya pharologano ya tsela e le nngwe; n = 3 go ya go 4 dipeba). Tshedimosetso e tlhagisiwa jaaka palogare ± SEM; ***P<0,001. (D) Moemedi FLIM setshwantsho bontša palogare ya botshelo jwa PN ya dibeke di le 7 e e tlhagisang kutlo ya glutathione redox Grx1-roGFP2 ka fa tlase ga maemo a a boletsweng a teko. LUT (tafole ya go leba) tekanyetso: sekgala sa nako ya go falola (ka picoseconds). Bara ya sekale, 25μm. (E) Histogram e bontsha kabo ya boleng jwa botshelo jwa Grx1-roGFP2 go tswa go (D) (n = 158 go ya go disele tsa 368 mo dipebeng tse pedi ka fa tlase ga boemo bongwe le bongwe). Tšhate ya phae e e fa godimo ga histokeramo nngwe le nngwe: e bontsha palo ya disele tse di nang le boleng jwa botshelo jo boleele thata (bohibidu, jo bo nang le oksijene) kgotsa jo bokhutshwane (botala jwa loapi, jo bo fokoditsweng), jo bo fetang 1 SD ya boleng jwa botshelo jo bo magareng mo CTRL-AAV-scr. (F) Mohlala o sisintsweng o bontsha phello e sireletsang ya upregulation ya PCx ya neuronal.
Ka kakaretso, tshedimosetso e re e nayang fano e bontsha gore go tlhagisiwa gape ga MFN2 go ka pholosa PN e e tsweletseng ka botlalo e e nang le tlhaelo e e masisi ya OXPHOS, go fokotsega ga mtDNA go go masisi, le popego e e sa tlwaelegang thata e e tshwanang le ista, ka jalo go tlamela ka kgatelopele e e tswelelang pele le mo malwetseng a a tsweletseng. Go senyega ga methapo go naya bosupi jo bo ka busediwang morago jwa kgato ya pele ga loso lwa sele. Tekanyo ena ya ho fetoha le maemo ya metaboliki e hatelloa hape ke bokgoni ba di-neuron ho hlohlelletsa atherosclerosis (ho hlophisa botjha ha potoloho ya TCA), e thibelang polelo ya PCx ho di-PN tse hlokang OXPHOS mme e ntlafatsa lefu la sele, ka tsela eo e bapala karolo ya ho sireletsa (Setshwantsho 5F).
Mo thutong eno, re ne ra ntsha bosupi jwa gore karabelo ya di-PN mo go sa direng sentle ga OXPHOS ke go kopana ka iketlo go ya kwa go TCA cycle atherosclerosis ka tsela ya go dira gore go nne le pharologano e e dirisiwang ke mananeo a metaboliki. Re netefaditse tshekatsheko ya proteomic ka mekgwa e mentsi e e tlaleletsang mme ra senola gore fa di gwetlhiwa ke go sa dire sentle ga mitochondrial go go masisi, di-neuron di na le mofuta o o neng o sa itsiwe pele wa go elasticity ga metaboliki. Re gakgamaditswe ke gore thulaganyo yotlhe ya go dira dithapo gape ga e tshwaye boemo jwa metaboliki jo bo tsamayang le go senyega ga methapo ka iketlo le ka tsela e e sa busediweng morago, mme tshedimosetso ya rona e bontsha gore e ka nna ya bopa neuron ya tlhokomelo le mo kgatong ya pele ga loso lwa sele Mokgwa wa go duelela disele o o dirang. Phitlhelelo eno e bontsha gore di- neuron di na le selekanyo se segolo sa go fetoga ga dijo mo mmeleng. Ntlha eno e supa gore go tsenngwa gape ga MFN2 moragonyana go ka busetsa morago go tlhagisiwa ga ditshwai tsa konokono tsa metaboliki le go thibela go senyega ga PN. Go na le moo, e thibela go thatafala ga ditshika le go akofisa ditshika. batho ba bong jo bo farologaneng.
Nngwe ya diphitlhelelo tse di kgatlhang thata mo patlisisong ya rona ke gore di-PN tse di tlhaelang OXPHOS di ka fetola metabolism ya modikologo wa TCA ka go laola di-enzyme tse di tlhotlheletsang ka tlhamalalo go koafala ga ditshika. Go rulaganngwa sešwa ga metaboliki ke ntlha e e tlwaelegileng ya disele tsa kankere, tse dingwe tsa tsone di ikaegileng ka glutamine go tlaleletsa di-intermediate tsa modikologo wa TCA go tlhagisa dilekanyo tse di fokotsang, tse di kgweetsang ketane ya go hema le go boloka tlhagiso ya di-precursor tsa biosynthesis tsa lipid le nucleotide (39 , 40). Thutopatlisiso ya bosheng e bontshitse gore mo dithishung tse di kwa ntle tse di itemogelang go sa dire sentle ga OXPHOS, go golaganngwa gape ga metabolism ya glutamine / glutamate le gone ke selo se se tlhageletseng (5, 41), moo tsela ya go tsena ga glutamine mo modikologong wa TCA e ikaegileng ka Ka ntlha ya bokete jwa kgobalo ya OXPHOS (41). ). Le fa go ntse jalo, ga go na bosupi jo bo tlhamaletseng ka ga go tshwana gope ga polasetiki ya metaboliki ya disele tsa boboko mo mmeleng le go nna maleba ga yone mo bokaong jwa bolwetse. Mo thutong ya bosheng ya vitro, di-neuron tsa ntlha tsa cortical di ne tsa bontshiwa go kokoanya matangwana a glutamate go fetisa methapo, ka jalo di rotloetsa metabolism ya oxidative le go koafala ga ditshika mo maemong a kgatelelo ya metaboliki (42). Go botlhokwa go ela tlhoko gore ka fa tlase ga thibelo ya melemo ya ensaeme ya modikologo wa TCA ya succinate dehydrogenase, go dumelwa gore carboxylation ya pyruvate e boloka go kopanngwa ga oxaloacetate mo di-neuron tsa ditlhaka tsa boboko tse di tlhomilweng (34). Le fa go ntse jalo, go amana ga mekgwa eno mo dithishung tsa boboko (mo go dumelwang gore atherosclerosis e amana le di-astrocyte thata) go sa ntse go na le botlhokwa jwa botlhokwa jwa mmele (43). Tabeng ena, ya data rona bontša hore PNs sentsweng ke OXPHOS ka 'mele ka fetoloa ho BCAA senyeha le pyruvate carboxylation, e leng mehloli e 'meli e ka sehloohong ea tlatsetso ea TCA letamo mahareng. Le fa seabe se se akanngwang sa BCAA catabolism mo metabolism ya maatla a disele tsa boboko se tshitshintswe, mo godimo ga seabe sa glutamate le GABA sa phetiso ya disele tsa boboko (44), ga go ise go nne le bosupi jwa mekgwa eno mo vivo. Ka jalo, go bonolo go fopholetsa gore di-PN tse di sa direng sentle di ka duelela tiriso ya di-intermediate tsa TCA tse di kgweediwang ke thulaganyo ya go tshwaetsa ka go oketsa bolwetse jwa go koafala ga ditshika. Ka ho khetheha, upregulation ya PCx e ka 'na ea hlokahala ho boloka tlhokeho e eketsehileng ea asiti ea aspartic, e leng e bontshitsoeng ka lisele tse ata le ho se sebetse ha mitochondrial (45). Le fa go ntse jalo, tshekatsheko ya rona ya metabolomics ga e a senola diphetogo dipe tse di botlhokwa mo selekanyong se se tlhomameng sa esiti ya aspartic mo di-PN tsa Mfn2cKO (Setshwantsho S6A), e e ka tswang e bontsha tiriso e e farologaneng ya metaboliki ya esiti ya aspartic fa gare ga disele tse di ntseng di ata le di-neuron tsa morago ga mitotic . Le fa mokgwa o o tlhomameng wa PCx upregulation mo di-neuron tse di sa direng sentle mo vivo o sa ntse o tshwanetse go tlhalosiwa, re ne ra bontsha gore karabo eno e e dirwang pele ga nako e na le seabe se se botlhokwa mo go bolokeng boemo jwa redox jwa di-neuron, jo bo neng jwa bontshiwa mo ditekong tsa FLIM mo diselaese tsa cerebellar. Ka ho khetheha, ho thibela PNs ho up-laola PCx ho ka lebisa ho boemo bo bongata ba oxidized le ho potlakisa lefu la sele. Go dira ga go senyega ga BCAA le go dira ga pyruvate ga se ditsela tsa go tlhaola dithishu tse di kwa ntle tsa go sa dire sentle ga mitochondrial (7). Ka jalo, go lebega e le selo se se tlang pele mo di-neuron tse di tlhaelang OXPHOS, le fa e se sone fela selo se se botlhokwa mo go senyegeng ga disele tsa boboko. .
Bolwetse jwa cerebellar ke mofuta o o sa tshwaneng wa bolwetse jwa go senyega ga methapo jo gantsi bo bonalang e le ataxia mme gantsi bo senya di-PN (46). Batho bano ba disele tsa boboko ba mo kotsing thata ya go sa dire sentle ga mitochondrial ka gonne go senyega ga tsone go go tlhophilweng mo dipebeng go lekane go tsala gape matshwao a le mantsi a go tsamaya a a tlhaolang ataxia ya spinocerebellar ya motho (16, 47, 48). Ho ya ka dipehelo, mohlala wa peba o fetotsweng o nang le lefutso le fetohang o amana le ataxia ya spinocerebellar ya batho mme o na le ho se sebetse ha mitochondrial (49, 50), ho hatisa bohlokwa ba ho ithuta ditlamorao tsa tlhaelo ya OXPHOS ho PNPH. Ka jalo, go tshwanela thata go tlhaola le go ithuta palo eno e e kgethegileng ya di- neuron ka katlego. Le fa go ntse jalo, ka ntlha ya gore di-PN di bosisi thata mo kgatelelong mme di dira karolo e e kwa tlase ya palo yotlhe ya disele tsa cerebellar, mo dithutong tse dintsi tse di theilweng mo di-omics, go di kgaoganya ka go tlhopha jaaka disele tsotlhe e sa ntse e le karolo e e gwetlhang. Le fa go batlile go sa kgonege go fitlhelela go tlhoka kgotlhelo e e feletseng ya mefuta e mengwe ya disele (bogolo jang dithishu tsa batho ba bagolo), re ne ra kopanya kgato e e atlegileng ya go kgaogana le FACS go bona palo e e lekaneng ya di-neuron tse di kgonang go sekasekwa ka proteomics e e kwa tlase, mme re na le poroteine ​​e e kwa godimo e e bapisiwang le diporoteine ​​tse di ka nnang 3000 the cerebel (51). Ka go boloka go kgona ga disele tsotlhe, mokgwa o re o nayang fano ga o re letle fela go tlhola diphetogo mo ditseleng tsa metaboliki mo di-mitochondria, mme gape le go tlhola diphetogo mo balekaneng ba yone ba cytoplasmic, e leng se se tlaleletsang tiriso ya go humisa letshwao la lera la mitochondrial le le kgethegileng mo mefuteng ya disele tsa michondria (52, 53). Mokgwa o re o tlhalosang ga o amane fela le thuto ya disele tsa Purkinje, mme o ka dirisiwa bonolo mo mofuteng ope fela wa sele go rarabolola diphetogo tsa metaboliki mo bobokong jo bo lwalang, go akaretsa le dikai tse dingwe tsa go sa dire sentle ga mitochondrial.
Kwa bofelong, re lemogile fensetere ya kalafi ka nako ya thulaganyo eno ya go rulaganya sešwa ga metaboliki e e ka busetsang morago gotlhelele matshwao a konokono a go ngomoga pelo ga disele le go thibela go senyega ga disele tsa boboko. Ka jalo, go tlhaloganya ditlamorago tsa go dira ga go tsenya dithapo gape tse di tlhalosiwang fano go ka nna ga re naya dintlha tsa motheo ka dikalafi tse di ka kgonegang tsa go boloka go kgona ga disele tsa boboko ka nako ya fa di-mitochondria di sa dire sentle. Dipatlisiso tsa isagwe tse di ikaeletseng go sekaseka diphetogo tsa metabolism ya maatla mo mefuteng e mengwe ya disele tsa boboko di a tlhokega go senola ka botlalo tiriso ya molaomotheo ono mo malwetseng a mangwe a methapo.
Dipeba tsa MitoPark di tlhalositswe mo nakong e e fetileng (31). Dipeba tsa C57BL/6N tse di nang le dijini tsa Mfn2 tse di bapileng le loxP di tlhalositswe mo nakong e e fetileng (18) mme tsa kgabaganngwa le dipeba tsa L7-Cre (23). Ditlogolwana tse di tlholegileng tse di sa tshwaneng tse pedi di ne tsa kgabaganngwa le dipeba tsa Mfn2loxP/Mfn2loxP tse di tshwanang go tlhagisa di-knockout tsa dijini tse di kgethegileng tsa Purkinje tsa Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre). Mo setlhopheng se sennye sa go nyalana, allele ya Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP (emisa-mtYFP) e ne ya tsenngwa ka difapaano tse dingwe (20). Ditsamaiso tsotlhe tsa diphologolo di ne tsa dirwa go ya ka dikaelo tsa Yuropa, tsa bosetšhaba le tsa setheo mme tsa amogelwa ke LandesamtfürNatur ya Umwelt le Verbraucherschutz, Rhine Bokone-Westphalia, Jeremane. Tiro ya diphologolo gape e latela kaelo ya Mokgatlho wa Yuropa wa Disaense tsa Diphologolo tsa Laboratori.
Morago ga go bolaya bogatsu mo go phatlogeng ga molomo wa popelo wa mosadi yo o imileng, lesea la peba le a kgaoganngwa (E13). Legogo le ne la kgaoganngwa mo Tharabololong ya Letswai le le Lekalekaneng la ga Hanks (HBSS) le le tlaleleditsweng ka Hepes ya 10 mM mme la fetisediwa mo Sedirisweng sa Ntsu e e Fetotsweng sa Dulbecco se se nang le papain (20 U/ml) le cysteine ​​(1μg/ml). Incubate dinama tse nyenyane tse ka DMEM) le ho arola e ke enzymatic tshilo ya dijo. Ml) ka 37°C metsotso e le 20, mme morago ga moo e silwe ka motšhini mo DMEM e e tlaleleditsweng ka 10% ya serum ya kgomo ya lesea le le mo popelong. Disele di ne di jalwa mo dikhurumelong tsa galase tse di apesitsweng ka polylysine ka kitlano ya 2×106 mo sejaneng sa setso sa 6 cm kgotsa ka kitlano ya 0.5×105 disele/cm2 go sekaseka ditshwantsho. Morago ga diura di le 4, sediriswa se ne sa emisediwa ka sediriswa se se senang serum sa Neurobasal se se nang le tlaleletso ya 1% ya B27 le 0.5 mM GlutaMax. Di-neuron di ne tsa bolokwa mo 37°C le 5% ya CO2 mo tekong yotlhe, mme tsa fepiwa gangwe ka beke. Gore go tlhotlheletse go kopanngwa gape mo vitro, 3μl (sejana sa setso sa didiba di le 24) kgotsa 0.5μl (poleiti ya didiba di le 24) ya vector e e latelang ya mogare wa AAV9 e ne ya dirisiwa go alafa di-neuron mo letsatsing la bobedi mo vitro: AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (Tlaleletso, nomoro ya lenaane la ditshedi 105530-AAV9) le AAV9.
DNA ya tlaleletso ya Mfn1 le Mfn2 ya peba (e e bonweng go tswa mo polasemiti ya Addgene #23212 le #23213, ka go latelana) di tshwailwe ka tatelano ya V5 (GKPIPNPLLGLDST) kwa pheletsong ya C, mme di kopantswe le mCherry mo foreimeng ka tatelano ya T2A. Grx1-roGFP2 ke mpho e e tswang kwa go TP Dick DFKZ wa Heidelberg (Setheo sa Dipatlisiso tsa Dipatlisiso sa Jeremane). Ka go emisetsa khasete ya tdTomato ka go dirisa mekgwa e e tlwaelegileng ya go dira ditshwantsho tse di tshwanang le tsa yone, khasete e ne ya tsenngwa ditshwantsho tse di tshwanang le tse dingwe mo mokwatleng wa pAAV-CAG-FLEX-tdTomato (nomoro ya tshupiso ya Addgene 28306) go tlhagisa pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFNGAV-V5, pAAV-CAG-FLEX-tdTomato. Divekete tsa FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 le tsa pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2. Leano le le tshwanang le ne la dirisiwa go tlhagisa vector ya taolo ya pAAV-CAG-FLEX-mCherry. Gore go kgonege go tlhagisa kago ya AAV-shPCx, go tlhokega sedirisiwa sa polasemiti sa AAV (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]), se se nang le tatelano ya DNA e e tsenyang khoutu ya shRNA e e lebaganeng le PCx ya peba ( 3′) Ka fa tlase ga taolo ya motlhotlheletsi wa U6, mCherry e dirisiwa ka fa tlase ga taolo ya motlhotlheletsi wa CMV. Tlhagiso ya divector tsa AAV tse di thusang e ne ya dirwa go ya ka ditaelo tsa motlhagisi (Cell Biolabs). Ka bokhutshwane, dirisa polasemiti ya phetiso e e tshotseng mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) ka nakwana Phetiso ya sele ya 2000. (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) kgotsa Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) e e tsenyang dikhoutu tsa jini, mmogo le go tsenya dikhoutu tsa poroteine ​​ya capsid ya AAV1 le poroteine ​​ya tlaleletso Go phuthela polasemiti ya polasemiti, go dirisiwa mokgwa wa fosefeite ya khalesiamo. Supernatant ya mogare o o tala e ne ya bonwa ka dipotologo tsa go gatsetsa-go thapologa mo bateng e e omileng ya aese/ethanol le disele tse di lysed mo letswaing le le thibetsweng ke phosphate (PBS). Vector ya AAV e ne ya phepafadiwa ka go tlhotlhora ga iodixanol e e sa tsweleleng (diura di le 24 ka 32,000 rpm le 4°C) mme ya tsepamisiwa ka go dirisa setlhotlhi sa Amicon sa ultra-15. Tekanyetso ya jenome ya AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [khopi ya jenome ya 2.9×1013 (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6.1×1012 GC/ml), AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6.1×1012 GC/ml), AAV1-CAG-FLEX e e kwadilweng ka selekanyo sa mmatota e ne ya lekanyediwa ka nako e e fetileng, e ne ya lekanyediwa ka nako e e fetileng; (qPCR) -MFN1-V5 (1,9 × 1013 GC / ml) le AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8,9 × 1012 GC / ml).
Di-neuron tsa motheo di ne tsa gogwa mo PBS e e tsididi jaaka aese ya 1x, tsa tsenngwa di-pellet, mme morago ga moo tsa kopanngwa mo 0.5% ya Triton X-100 / 0.5% ya sodium deoxycholate/PBS e e nang le phosphatase le thibela-protease (Roche). Tekanyetso ya poroteine ​​e ne ya dirwa ka go dirisa tlhatlhobo ya esiti ya bicinchoninic (Thermo Fisher ya Saense). Diporoteine ​​di ne tsa kgaoganngwa ka go dirisa motlakase wa SDS-polyacrylamide, mme morago ga moo tsa tlhotlhorwa mo leraleng la fluoride la polyvinylidene (GE Healthcare). Thibela mafelo a a sa kgethegang mme o tlhotlheletse ka twantsho ya motheo (bona Lenaneo S1 go bona dintlha) mo mašwing a 5% mo TBST (Tris-buffered saline le Tween), dikgato tsa go tlhatswa le twantsho ya bobedi mo TBST Incubate. E tlhotlheletse ka twantsho ya motheo bosigo jotlhe ka +4°C. Morago ga go tlhapa, dirisa twantsho ya bobedi diura di le 2 ka themperetšha ya phaposi. Morago ga moo, ka go tlhotlheletsa lebala le le tshwanang le selwantsha-β-actin, go ne ga netefadiwa gore go na le morwalo o o tshwanang. Go lemogwa ka go fetolela go khemikhale le go tokafatsa khemikhale (GE Healthcare).
Di-neuron tse di neng di jaletswe pele mo dikhurumelong tsa galase di ne tsa tlhomamisiwa ka 4% ya paraformaldehyde (PFA)/PBS ka nako e e beilweng mo themphereitšheng ya phaposi metsotso e le 10. Dikhurumetso di tsenngwa pele ka 0.1% Triton X-100/PBS metsotso e le 5 mo themphereitšheng ya phaposi, mme morago ga moo di tsenngwe mo sethibelong [3% ya albumin ya serum ya dikgomo (BSA)/PBS]. Ka letsatsi la bobedi, di-coverslip di ne tsa tlhatswiwa ka sethibela-malwetse mme tsa tlhokomelwa ka selwantsha-mogare sa bobedi se se maleba se se kopantsweng le fluorophore diura di le 2 ka themperetšha ya phaposi; kwa bofelong, disampole di ne tsa tlhatswiwa sentle mo PBS ka 4′,6-diamidino-2 -Phenylindole (DAPI) e a tshwaiwa mme morago ga moo e tlhomamisiwa mo selaeteng sa maekerosekopo ka Aqua-Poly/Thaba.
Dipeba (tse ditonanyana le tse di namagadi) di ne tsa bolawa ke go tlhabelwa ketamine (130 mg/kg) le xylazine (10 mg/kg) mo teng ga letlalo mme tsa tsenngwa ka fa tlase ga letlalo ka seokobatsi sa go okobatsa ditlhabi sa carprofen (5 mg/kg) , Mme tsa bewa mo sedirisiweng sa go tlhotlhora se se nang le ditlhabi (Kopd a). Penola legata mme o dirise borele jwa meno go fokotsa karolo ya cerebellar cortex e e tsamaelanang le lerapo la mis (go tswa mo lambda: mogatla 1.8, lateral 1, e e tsamaelanang le lobules IV le V). Dirisa naletsana ya sering e e kobegileng go dira phatla e nnye ka kelotlhoko mo legatleng go tila go kgoreletsa ditshika tse di fa tlase. Morago ga moo capillary ya galase e e gogilweng e tshesane e tsenngwa ka iketlo mo lehuting le lennye (go tswa go -1.3 go ya go -1 mo letlhakoreng la ventral la dura mater), mme 200 go ya go 300 nl ya AAV e tsenngwa mo setlhabelong se sennye (Narishige) ka disirinji tsa diatla (Narishige tisure) ka nako ya kgatelelo ya fensetere ya metsotso. Morago ga go tshelwa, baya capillary metsotso e mengwe e le 10 go letla mogare go anama gotlhelele. Fa di-capillary di sena go gogwa, letlalo le rokiwa ka kelotlhoko go fokotsa thurugo ya ntho le go letla phologolo go fola. Diphologolo di ne tsa alafiwa ka diokobatsi tsa ditlhabi (caspofen) malatsi a le mmalwa morago ga karo, mo nakong eo boemo jwa tsone jwa mmele bo ne jwa bewa leitlho ka kelotlhoko mme morago ga moo di ne tsa bolawa ka nako e e beilweng. Ditsamaiso tsotlhe di ne tsa dirwa go ya ka dikaelo tsa Yuropa, tsa bosetšhaba le tsa setheo mme di ne tsa amogelwa ke LandesamtfürNatur ya Umwelt le Verbraucherschutz, kwa Rhine Bokone-Westphalia, kwa Jeremane.
Diphologolo di ne tsa bolaya bogatsu ka ketamine (100 mg/kg) le xylazine (10 mg/kg), mme pelo e ne ya tshelwa ka 0.1 M PBS pele, mme morago ga moo ka 4% PFA mo PBS. Dinama tse nyenyane tse di ile tsa arolwa mme tsa tsitsiswa ka 4% PFA / PBS bosiu ka 4 ° C. Thipa e e roromang (Leica Microsystems GmbH, Vienna, Austria) e ne ya dirisiwa go baakanya dikarolo tsa sagittal (tse di bokima jwa 50 μm) go tswa mo bobokong jo bo tlhomameng mo PBS. Ntle le fa go tlhalositswe ka tsela e sele, go tshasiwa ga dikarolo tse di phaphametseng ka kgololesego go ne ga dirwa jaaka go tlhalositswe fa godimo (13) ka themperetšha ya phaposi le go fuduwa. Ka bokhutshwane, sa ntlha, dilae tse di bonweng di ne tsa tsenelela ka 0.5% Triton X-100/PBS metsotso e le 15 ka themperetšha ya phaposi; bakeng sa di-epitope tse ding (Pcx le Shmt2), ka ho buffer ya tris-EDTA ka 80°C (PH 9) futhumatsa diselaese metsotso e 25 ho ena le kgato ena. Morago ga moo, dikarolo di ne tsa tlhokomelwa ka twantsho ya ntlha (bona Lenaneo S1) mo sethibelong se se thibelang (3% BSA/PBS) ka 4°C bosigo jotlhe ka go fuduwa. Letsatsi le le latelang, dikarolo di ne tsa tlhatswiwa ka buffer e e thibelang mme tsa tlhokomelwa ka selwantsha-mogare se se tshwanetseng sa bobedi se se kopantsweng le fluorophore diura di le 2 ka themperetšha ya phaposi; kwa bofelong, dikarolo di ne tsa tlhatswiwa sentle mo PBS, tsa tshasiwa ka DAPI, mme tsa tlhomamisiwa ka AquaPolymount Mo selaeteng sa maekerosekopo.
Go ne ga dirisiwa maekerosekopo ya go sekaseka ka laser (TCS SP8-X kgotsa TCS Letlhare la Lesedi la Dijithale, Leica Microsystems) e e nang le laser ya lesedi le lesweu le laser ya ultraviolet ya diode ya 405 go ne ga dirisiwa go tsaya setshwantsho sa sampole. Ka go itumedisa fluorophore le go kokoanya letshwao ka Hybrid Detector (HyDs), serweboleta sa LAS-X se ne sa dirisiwa go kokoanya ditshwantsho tse di kgobokantsweng tse di tsamaelanang le go tsaya disampole ga Nyquist ka mokgwa wa tatelano: mo diphaneleng tse di sa lekanyediweng, ke matshwao a a maatla thata (ka sekai, mo diseleng tsa mmele le mo di-dendrite tsa PDN) mt Mokgwa wa BrightR). Gating ya 0.3 go ya go 6 ns e a dirisiwa go fokotsa lemorago.
Ditshwantsho tsa nako ya nnete tsa disele tse di tlhophilweng. Morago ga go tlhaola mo sedirisiweng sa Neurobasal-A se se nang le tlaleletso ya 1% ya B27 le 0.5 mM GlutaMax, disele di ne tsa jalwa ka bonako mo diselaeteng tsa galase tse di apesitsweng ka poly-l-lysine (μ-Selaete8 Sediba, Ibidi, nomoro ya lenaane la disele 80826) , Mme morago ga moo tsa e boloka mo 1% ya CO2 go ya go 3700. go tlhomama. Ditshwantsho tsa nako ya nnete di ne tsa dirwa mo maekerosekopo ya confocal ya go sekaseka ka laser ya Leica SP8 e e nang le lense e tshweu ya laser, HyD, 63 × [1.4 aperture ya dipalo (NA)] le sethala sa go thuthafatsa.
Peba e ne ya bolawa ka bonako ka khabonetaeokosaete mme ya kgaolwa tlhogo, boboko bo ne jwa tlosiwa ka bonako mo legatleng, mme jwa kgaolwa go nna 200μm ka bokima (bakeng sa teko ya go tshwaya ya 13C) kgotsa 275μm ka bokima (bakeng sa diteko tse pedi tsa photon) karolo ya sagittal e e tletseng ka didirisiwa tse di latelang tsa crece (VH-5r5). Saense, Walldorf, Jeremane) e tletse ka dilo tse di latelang: 125 mM e e tsididi jaaka aese, e e tletseng khabone (95% ya O2 le 5% ya CO2) e e nang le Ca2 e e kwa tlase + seeledi sa maitirelo sa boboko (ACSF) NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM sodium pho5. sukiri, 0.5 mM CaCl2 le 3.5 mM MgCl2 (kgatelelo ya osmotic ya 310 go ya go 330 mmol). Fetisetsa diselaese tsa boboko tse di bonweng kwa phaposing ya pele ga go tlhotlhora e e nang le Ca2 + ACSF e e kwa godimo (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM sethibela-fosefeite sa sodiamo, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-sukiri ya Ca2M le 1. MgCl2) Bogare) pH 7.4 le 310 go ya go 320 mmol).
Ka nako ya thulaganyo ya go tsaya ditshwantsho, diselaese di ne tsa sutisediwa kwa phaposing e e kgethegileng ya go tsaya ditshwantsho, mme tekeletso e ne ya dirwa ka fa tlase ga go tshelwa ga ACSF go go tswelelang ka themperetšha e e sa fetogeng ya 32° go ya go 33°C. Go ne ga dirisiwa maekerosekopo ya go sekaseka ka laser ya difothone tse dintsi (TCS SP8 MP-OPO, Dithulaganyo tse dinnye tsa Leica) e e nang le lense ya Leica 25x e e nang le maitlhomo (NA 0.95, metsi), laser ya Ti: Safira (Chameleon Vision II, Coherent) go tsaya ditshwantsho tsa diselaese. Mojule wa FLIM (PikoHarp300, PikoKwante).
FLIM ya Grx1-roGFP2. Diphetogo mo seemong sa redox sa cytoplasmic sa di-PN di ne tsa lekanngwa ka FLIM ya difothone tse pedi mo diselaese tsa boboko jwa sagittal, moo biosensor ya Grx1-roGFP2 e neng e lebile di-PN. Mo llageng ya PN, lefelo la go bona le tlhophiwa mo e ka nnang 50 go ya go 80 μm ka fa tlase ga boalogodimo jwa selae go netefatsa gore go na le PN e e kgonang go dira (ke gore, go tlhoka popego ya dipheta kgotsa diphetogo tsa popego ya disele tsa boboko go bapa le di-dendrite) le sensara ya roGFP2 e e siameng gabedi ya coGFP2 le go tsenya khoutu ya AAVx iRNA sh mTšheri). Kgobokanya ditshwantsho tsa mokgobo o le mongwe ka zoom ya dijithale ya 2x [boleele jwa makhubu a go tlhotlheletsa: 890 nm; 512 nm dipiksele di le 512]. Temogo: HyD ya ka fa gare, setlhopha sa setlhotlhi sa fluorescein isothiocyanate (FITC)] le palogare ya setshwantsho mo metsotsong e le 2 go ya go e le 3 di dirisiwa go netefatsa gore go kokoanngwa difothone tse di lekaneng (difothone di le 1000 ka kakaretso) go tshwanela sebopego sa sebopego. Bosisi jwa patlisiso ya Grx1-roGFP2 le netefatso ya maemo a FLIM di ne tsa dirwa ka go baya leitlho boleng jwa botshelo jwa roGFP2 fa go tsenngwa H2O2 ya 10 mM e e tswang kwa ntle mo ACSF e e tshelwang (go oketsa go fokotsa oksijene, mme seno se felela ka gore go nne le nako e e oketsegileng ya botshelo), mme morago ga moo go oketsa mrethizethol ya botshelo). phokotsego, e e felelang ka phokotsego ya botshelo) (Setshwantsho S8, D go ya go G). Dirisa sofotewere ya FLIMfit 5.1.1 go sekaseka dipholo tse di bonweng, tshwanela sebopego se le sengwe sa go bola ga setshwantsho sotlhe go IRF e e lekanyeditsweng (tiro ya tsibogo ya sedirisiwa), mme χ2 e ka nna 1. Go bala nako ya botshelo ya maseke o le mongwe, maseke o ne o gogwa ka seatla nako ya botshelo go dikologa tshika. e dirisiwa go dira dipalopalo.
Tshekatsheko ya bokgoni jwa mitochondria. Morago ga gore karolo e e bogale e tlhokomelwe ka 100 nM TMRM e e tsentsweng ka tlhamalalo mo ACSF e e tshetsweng metsotso e le 30, diphetogo tsa bokgoni jwa mitochondrial tsa di-PN di ne tsa lekanngwa ka maekerosekopo ya difothone tse pedi. Go tsaya ditshwantsho ka TMRM go ne ga dirwa ka go itumedisa probe ka 920 nm le go dirisa HyD ya ka fa gare (isothiocyanate ya tetramethylrhodamine: 585/40 nm) go kokoanya matshwao; ka go dirisa boleele jo bo tshwanang jwa makhubu a go tsosa mme o dirisa HyD e e farologaneng ya ka fa gare (FITC :525/50) go dira setshwantsho sa mtYFP. Dirisa polaka ya ImageJ ya Sebadi sa Ditshwantsho go sekaseka bokgoni jwa mitochondrial mo maemong a sele e le nngwe. Ka bokhutshwane, ikhweišene ya polaka: letshwao = motsotso (mtYFP, TMRM) e dirisiwa go supa kgaolo ya mitochondrial e e bontshang letshwao la TMRM ka Purkinje Somali mo setshwantshong sa confocal sa mokgobo o le mongwe sa kanale e e tsamaelanang. Ebe sebakeng sa dipikselse ka maske sephetho le quantified, 'me joale tlwaelehileng ka monyako tshwanelanang e le 'ngoe-mokgobo setshwantsho sa mtYFP kanaleng ho fumana karolwana mitochondrial bontša bokgoni mitochondrial.
Setshwantsho seno se ne sa tlhatlosiwa ka serweboleta sa Huygens Pro (Go Tshwara Ditshwantsho tsa Bolumu ya Saense). Bakeng sa ditshwantsho tse skenwang tsa dithaele, ho kopanngwa ha thaele e le nngwe ho etswa ho sebediswa algorithm ya ho roka e iketsang e fanweng ke mananeo a khomphyutha a LAS-X. Morago ga go lekanyetsa setshwantsho, dirisa ImageJ le Adobe Photoshop go tswelela go dira setshwantsho le go fetola go phatsima le pharologano ka go tshwana. Dirisa Adobe Illustrator go baakanyetsa ditshwantsho.
mtDNA tsepamisa tshekatsheko. Palo ya dintho tsa mtDNA e ne ya lekanngwa mo dikarolong tsa cerebellar tse di neng di tshwailwe ka dilwantsha-ditwatsi kgatlhanong le DNA ka maekerosekopo ya confocal. Lefelo lengwe le lengwe le le ikaeletsweng le ne la direlwa mmele wa sele le nyutlease ya sele nngwe le nngwe, mme lefelo le le farologaneng le ne la balelwa go dirisiwa polaka ya Multi Measure (sofotewere ya ImageJ). Ntsha lefelo la nyutlea mo lefelong la mmele wa sele go bona lefelo la cytoplasmic. Qetellong, plug-in ya Analyze Particles (software ya ImageJ) e ne e sebediswa ho lekanya dintlha tsa DNA tsa cytoplasmic tse bontshang mtDNA setshwantshong sa monyako, mme diphetho tse fumanweng di ile tsa tlwaeleha ho palohare ya PN ya dipeba tsa CTRL. Dipholo di tlhagisiwa jaaka palogare ya palo ya dinyukleoside ka sele.
Tshekatsheko ya tlhagiso ya poroteine. Dirisa polaka ya ImageJ ya Image Calculator go sekaseka tlhagiso ya poroteine ​​mo PN mo maemong a sele e le nngwe. Ka bokhutshwane, mo setshwantshong sa confocal sa lera le le lengwe sa kanale e e tsamaelanang, ka ikhweišene: letshwao = motsotso (mtYFP, twantsho), kgaolo ya mitochondrial e e bontshang go tsibogela selwantshamegare se se rileng kwa Purkina e a supiwa. Ebe sebakeng sa dipikselse ka maske sephetho le quantified, 'me joale tlwaelehileng ka monyako tshwanelanang e le 'ngoe-mokgobo setshwantsho sa mtYFP kanaleng ho fumana mitochondrial karolwana ya protheine bontshiweng.
Tshekatsheko ya kitlano ya disele tsa Purkinje. Plug-in ya Cell Counter ya ImageJ e ne ya dirisiwa go sekaseka kitlano ya Purkinje ka go arola palo ya disele tsa Purkinje tse di badilweng ka boleele jwa lesale la cerebellar le le tserweng ke disele tse di badilweng.
Go baakanyetsa le go kokoanya disampole. Boboko jo bo tswang mo setlhopheng sa taolo le dipeba tsa Mfn2cKO bo ne jwa tlhomamisiwa mo 2% PFA / 2.5% ya glutaraldehyde mo sethibelong sa fosefeite sa 0.1 M (PB), mme morago ga moo dikarolo tsa coronal di ne tsa baakanngwa go dirisiwa di-ciliate (Leica Mikrosysteme GmbH, Vienna, Austria) (Bokima jwa sethibela-matlho 50 go ya go 600). tetraoxide le 1.5% ya potasiamo ferrocyanide ka themperetšha ya phaposi ura e le 1. Dikarolo di ne tsa tlhatswiwa makgetlo a le mararo ka metsi a a tlhotlhilweng, mme morago ga moo tsa tshasiwa ka 70% ya ethanol e e nang le 1% ya uranyl acetate metsotso e le 20. Dikarolo di ne tsa tlhoka metsi mo bojalweng jo bo tlhophilweng mme tsa tsenngwa mo resining ya epoxy ya Durcupan ACM (resine ya go latlhela ya Araldite M) (Disaense tsa Maekerosekopo ya Eleketeroniki, nomoro ya lenaane la dibuka 14040) fa gare ga diselaete tsa galase tse di apesitsweng ka silikhone, mme kwa bofelong ka 60°C Polymerize48 mo ontong. Lefelo la legogo la boboko le ne la tlhophiwa mme dikarolo tse di sesane thata tsa 50 nm tsa segiwa mo Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Vienna, Austria) mme tsa kgetlwa mo keriting ya phatlha ya kopore ya 2 × 1 mm e e apesitsweng ka filimi ya polystyrene. Dikarolo di ne tsa tshasiwa ka tharabololo ya 4% uranyl acetate mo H2O metsotso e le 10, tsa tlhatswiwa ka H2O makgetlo a le mmalwa, morago ga moo ka Reynolds lead citrate mo H2O metsotso e le 10, mme morago ga moo tsa tlhatswiwa ka H2O makgetlo a le mmalwa. Dimaekerokerafo di ne tsa tsewa ka maekerosekopo ya eleketerone ya phetiso ya Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) go dirisiwa khamera ya dijithale ya TVIPS (Tsamaiso ya go Dira Dibidio le Ditshwantsho ya Tietz) ya TemCam-F416 (TVIPS GmbH, Gauting, USA). Jeremane).
Bakeng sa dipeba tse tshwaeditsweng ke AAV, boko bo ile ba arolwa mme ba kgaolwa ho ba karolo ya sagittal e botenya ba 1 mm, mme cerebellum e ile ya hlahlojwa ho sebediswa maekerosekopo ya fluorescence ho hlwaya lesale le tshwaeditsweng ke AAV (ke hore, mCherry e hlahisang). Ke diteko fela tse mo go tsona go tlhabelwa ga AAV go felelang ka bokgoni jo bo kwa godimo thata jwa phetolelo ya lera la sele ya Purkinje (ke gore mo e ka nnang lera lotlhe) mo bonnyeng diring tse pedi tse di latelanang tsa cerebellar tse di dirisiwang. Loop e e fetotsweng ke AAV e ne ya kgaoganngwa ka bonnye gore e tlhomamisiwe bosigo jotlhe morago ga go tlhomamisiwa (4% PFA le 2.5% glutaraldehyde mo sethibelong sa cocoate sa 0.1 M) mme ya dirisiwa go ya pele. Bakeng sa ho kenngwa ha EPON, dinama tse nyenyane tse tsitsitseng di ile tsa hlatswa ka 0.1 M ya sethibela-cocoate sa sodiamo (Applichem), mme tsa tlhokomelwa ka 2% OsO4 (os, Ditshebeletso tsa Saense; Caco) ka 0.1 M ya sethibela-cocoate sa sodiamo (Applichem) Dihora tse 4, ebe di hlatswa dihora tse 2. Boeletsa makgetlo a le 3 ka sethibela-cocamide sa 0.1 M. Morago ga moo, motseletsele o o tlhatlogang wa ethanol o ne wa dirisiwa go tlhotlheletsa tharabololo nngwe le nngwe ya ethanol ka 4°C metsotso e le 15 go ntsha metsi mo thishung. Dithishu di ne tsa fetisediwa kwa oksaeteng ya propylene mme tsa tlhokomelwa bosigo jotlhe mo EPON (Sigma-Aldrich) ka 4°C. Beha dinama tse nyenyane tse ka EPON e foreshe ka themphereitjha ya phaposi bakeng sa dihora tse 2, mme o e kenye ka 62°C bakeng sa dihora tse 72. Dirisa ultramicrotome (Leica Microsystems, UC6) le thipa ya teemane (Diatome, Biel, Switzerland) go sega dikarolo tse di sesane thata tsa 70 nm, mme o di tshase ka 1.5% ya uranyl aseteite metsotso e le 15 kwa 37°C, mme o tshase ka tharabololo ya citrate ya lloto metsotso e le 4. Dimaekerokerafo tsa eleketeroniki di tserwe ka go dirisa maekerosekopo ya eleketeroniki ya phetiso ya JEM-2100 Plus (JEOL) e e nang le serweboleta sa Camera OneView 4K sa 16-bit (Gatan) le serweboleta sa DigitalMicrograph (Gatan). Go sekasekwa, di-micrograph tsa eleketeroniki di ne tsa bonwa ka zoom ya dijithale ya 5000× kgotsa 10,000×.
Tshekatsheko ya popego ya di-mitochondria. Bakeng sa ditshekatsheko tsohle, dikonturu tsa di-mitochondria ka bomong di ne di hlalositswe ka letsoho ditshwantshong tsa dijithale ho sebediswa mananeo a ImageJ. Dipharametara tse di farologaneng tsa popego di a sekasekwa. Kitlano ya di-mitochondria e tlhagisiwa jaaka phesente e e bonwang ka go kgaoganya lefelo lotlhe la di-mitochondria la sele nngwe le nngwe ka lefelo la cytoplasm (lefelo la cytoplasm = lefelo la sele-lefelo la nyutlea ya sele) × 100. Bokgolokwe jwa di-mitochondria bo balelwa ka fomula [4π∙2(lefelo)]./perimeter. Popego ya ista ya mitochondria e ne ya sekasekwa mme ya kgaoganngwa ka ditlhopha tse pedi (“tubular” le “blister”) go ya ka dipopego tsa tsone tse dikgolo.
Palo ya autofagosome/lysosome le tshekatsheko ya kitlano. Dirisa serweboleta sa ImageJ go tlhalosa ka seatla dikonturu tsa autophagosome/lysosome nngwe le nngwe mo setshwantshong sa dijithale. Lefelo la autophagosome/lysosome le tlhagisiwa jaaka phesente e e balelwang ka go arola karolo yotlhe ya popego ya autophagosome/lysosome ya sele nngwe le nngwe ka lefelo la saetepolasema (lefelo la saetopolasema=lefelo la sele-lefelo la nyutlease)×100. Kitlano ya di-autophagosome/di-lysosome e balelwa ka go arola palo yotlhe ka palo ya dibopego tsa di-autophagosome/di-lysosome ka sele (go ya ka lefelo la cytoplasmic) (lefelo la cytoplasmic = lefelo la sele-lefelo la nyutlelia).
Go tshwaya go kgaoganya ka bogale le go baakanyetsa sampole. Bakeng sa diteko tse hlokang ho tshwaya ha tsoekere, fetisetsa diselaese tse bohale tsa boko phaposing ya pele ho ho hlahisa, e nang le khabone e tletseng (95% O2 le 5% CO2), Ca2 + ACSF e phahameng (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM sodiamo m2 phosphate. 25.0 mM d-sukiri, 1.0 mM CaCl 2 le 2.0 mM MgCl 2, e e fetotsweng go pH 7.4 le 310 go ya go 320 mOsm), e mo go yona sukiri e leng 13 C 6- Go emisetsa sukiri (Eurisotop, nomoro ya lenaane69-1). Bakeng sa diteko tse hlokang ho tshwaiwa ka pyruvate, fetisetsa diselaese tse bohale tsa boko ho Ca2 + ACSF e hodimo (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM sethibela-fosefeite sa sodiamo, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glucose ya Ad2M le MgCl2, fetolela go pH 7.4 le 310 go ya go 320mOsm), mme o tsenye 1mM 1-[1-13C]pyruvate (Eurisotop, nomoro ya lenaane la dibuka CLM-1082). Hlahisa dikarolo metsotso e 90 ka 37°C. Kwa bokhutlong jwa tekeletso, dikarolo di ne tsa tlhatswiwa ka bonako ka tharabololo ya metsi (pH 7.4) e e nang le khaboneite ya ammoniamo ya 75 mM, mme morago ga moo tsa kopanngwa mo 40:40:20 (v:v:v) asetonitrile (ACN): methanol: metsi. Morago ga gore dikarolo di tlhotlhorege mo aese metsotso e le 30, disampole di ne tsa tlhotlhorega ka 21,000 g metsotso e le 10 ka 4°C, mme supernatant e e phepa e ne ya omisiwa mo setlhotlheletsing sa SpeedVac. Pellet ya metabolite e e omisitsweng e e tlholegileng e ne ya bolokwa kwa -80°C go fitlha e sekasekwa.
Tshekatsheko ya diaminoesiti di le 13 tse di tshwailweng ka C. Bakeng sa tlhahlobo ya sebopeho sa metsi (LC-MS), pellet ya metabolite e ile ya hlophiswa botjha ka 75μl ya metsi a sehlopha sa LC-MS (Honeywell). Morago ga go tlhotlhora ka 21,000 g metsotso e le 5 ka 4°C, 20 μl ya supernatant e e tlhalositsweng e ne ya dirisiwa go sekaseka kelelo ya amino acid, fa tlhotlholetso e e setseng e ne ya dirisiwa ka bonako go sekaseka anion (bona fa tlase). Tshekatsheko ya diesiti tsa amino e ne ya dirwa ka go dirisa porothokholo ya go tswa ga benzoyl chloride e e tlhalositsweng pelenyana (55, 56). Mo kgatong ya ntlha, 10μl ya 100 mM ya sodiamo khaboneite (Sigma-Aldrich) e ne ya okediwa mo 20μl ya tlhotlhoriso ya metabolite, mme morago ga moo 10μl ya 2% ya benzoyl tleloraete (Sigma-Aldrich) e ne ya okediwa mo ACN ya mophato wa LC. Sampole e ne ya tlhotlhorega ka bokhutshwane mme morago ga moo ya tlhotlhorega ka 21,000 g metsotso e le 5 ka 20°C. Fetisetsa supernatant e e phepafaditsweng mo lebotlolong la autosampler la 2 ml le le nang le tsenyo ya galase ya khoune (bolumu ya 200 μl). Disampole di ne tsa sekasekwa ka go dirisa thulaganyo ya LC ya Acquity iClass e e dirang sentle thata (Metsi) e e golagantsweng le Q-Exactive (QE)-HF (Orbitrap ya Tshimo e e kwa Godimo thata) ya sepekterometara sa bokete jo bo kwa godimo (Thermo Fisher Scientific). Bakeng sa tshekatsheko, 2μl ya sampole e e tswang mo go yone e ne ya tsenngwa mo kholomong ya silica T3 ya maatla a a kwa godimo ya 100 × 1.0 mm (Metsi) e e nang le dikarolwana tsa 1.8 μm. Seelo sa kelelo ke 100μl/motsotso, mme thulaganyo ya sethibela e na le sethibela A (10 mM ammonium formate le 0.15% ya esiti ya formic mo metsing) le sethibela B (ACN). Mothalo o ka tsela e e latelang: 0%B ka metsotso e le 0; 0%B. 0 go ya go 15% B ka metsotso e le 0 go ya go 0.1; 15 go ya go 17% B ka metsotso e le 0.1 go ya go 0.5; B ka 17 go ya go 55% ka metsotso e le 0.5 go ya go 14; B ka 55 go ya go 70% ka metsotso e le 14 go ya go 14.5; ka 14.5 go ya go 70 go ya go 100% B ka metsotso e le 18; 100% B ka metsotso e le 18 go ya go e le 19; 100 go ya go 0% B ka metsotso e le 19 go ya go e le 19.1; 0% B ka metsotso e le 19.1 go ya go e le 28 (55, 56). The QE-HF boima spectrometer sebetsa ka mokgwa wa ionization e ntle le boima mefuta e fapaneng ya m / z (boima / qoso ratio) ya 50 ho 750. The sebediswa qeto ke 60,000, 'me phaello taolo (AGC) ion sepheo fumanweng ke 3 × 106, 'me palo e kahodimodimo ion milli0conds nako ke. Motswedi wa ionization ya electrospray e e goteditsweng (ESI) o dira ka maatla a go gasa a 3.5 kV, themperetšha ya capillary ya 250°C, kelelo ya mowa wa sheath ya 60 AU (diyuniti tse di sa tlhomamang), le kelelo ya mowa e e thusang ya 20 AU. 250°C. Lense ya S e setilwe go 60 AU.
Tshekatsheko ya kromatokerafi ya anion-MS ya diesiti tsa manyolo tse di tshwailweng ka 13C. Setlhotlhori se se setseng sa metabolite (55μl) se ne sa sekasekwa ka go dirisa thulaganyo ya kromatokerafi ya ione ya Dionex (ICS 5000+, Saense ya Thermo) e e golagantsweng le sepekterometara sa bokete sa QE-HF (Saense ya Thermo Fisher). Ka bokhutshwane, 5 μl ya tlhotlhoriso ya metabolite e ne ya tlhabelwa mo kholomong ya Dionex IonPac AS11-HC e e nang le HPLC (2 mm × 250 mm, bogolo jwa dikarolwana 4 μm, Thermo Fisher Saense) ka mokgwa wa go kgarametsa mo karolong ya loop ka selekanyo sa go tlatsa sa 1. )on. Kholomo ya molebedi ya Dionex IonPac AG11-HC (2 limilimithara x 50 limilimithara, 4 μm, Saense ya Motshwaraditlhapi wa Thermo). Themphereitšhara ya kholomo e bolokwa e le 30°C, mme autosampler e bewa go 6°C. Dirisa khatritšhe ya potasiamo haeterokosaete e e tlametsweng ka metsi a a deionized go tlhagisa mothalo wa potasiamo haeterokosaete ka jenereitara ya eluent. Kgaogano ya dimetabolite ka seelo sa kelelo sa 380μl/motsotso, go dirisa mothalo o o latelang: metsotso e le 0 go ya go e le 3, 10 mM KOH; Metsotso e le 3 go ya go e le 12, KOH ya 10 go ya go e le 50 mM; Metsotso e le 12 go ya go e le 19, 50 go ya go e le 100 mM KOH; Metsotso e le 19 go ya go e le 21 , KOH ya 100 mM; Metsotso e le 21 go ya go e le 21.5, KOH ya 100 go ya go e le 10 mM. Kholomo e ne ya lekalekanngwa gape ka fa tlase ga 10 mM KOH metsotso e le 8.5.
Di-metabolite tse di tlhotlhilweng di kopanngwa le molapo wa tlaleletso wa isopropanol wa 150μl/motsotso morago ga kholomo mme morago ga moo di lebisiwe kwa sepektherometerng sa bokete sa tharabololo e e kwa godimo se se dirang ka mokgwa wa ionization o o sa siamang. MS e beile leitlho selekanyo sa bokete go tswa go m/z 50 go ya go 750 ka tharabololo ya 60,000. AGC e behilwe ho 1 × 106, mme nako e hodimo ya ion e bolokwa ho 100 ms. Motswedi wa ESI o o goteditsweng o ne o dirisiwa ka maatla a go gasa a 3.5 kV. Dipeakanyo tse dingwe tsa motswedi wa ion di ka tsela e e latelang: themperetšha ya capillary 275°C; kelelo ya gase ya kgapetla, 60 AU; kelelo ya gase e e thusang, 20 AU ka 300°C, le go seta lense ya S go 60 AU.
Tshekatsheko ya tshedimosetso ya dimetabolite tse di tshwailweng ka 13C. Dirisa serweboleta sa TraceFinder (mofuta wa 4.2, Saense ya Thermo Fisher) go sekaseka tshedimosetso ya tekanyetso ya isotope. Boitshupo jwa motswako mongwe le mongwe bo ne jwa netefadiwa ke motswako o o ikanyegang wa tshupiso mme jwa sekasekwa ka go ikemela. Gore go dirwe tshekatsheko ya go humisa di-isotope, lefelo la chromatogram ya ion e e ntshitsweng (XIC) ya isotope nngwe le nngwe ya 13C (Mn) le ne la ntshiwa mo [M + H] +, mo n e leng palo ya khabone ya motswako o o ikaeletsweng, e e dirisiwang go sekaseka diaminoesiti kgotsa [ MH] + e dirisiwa go sekaseka di-anion. Boima ba ho nepahala ha XIC bo ka tlase ho dikarolo tse hlano ka milione, mme ho nepahala ha RT ke metsotso e 0.05. Tshekatsheko ya go humisa e dirwa ka go bala selekanyo sa isotope nngwe le nngwe e e lemogilweng go palo ya di-isotope tsotlhe tsa motswako o o tsamaelanang. Ditekanyetso tseno di neelwa jaaka boleng jwa diperesente tsa isotope nngwe le nngwe, mme dipholo di tlhagisiwa jaaka go humisa ga diperesente tsa molar (MPE), jaaka go tlhalositswe pelenyana (42).
Pellet e e gatseditsweng ya di-neuron e ne ya kopanngwa mo methanol e e tsididi jaaka aese ya 80% (v/v), ya tlhotlhorega, mme ya tlhokomelwa ka -20°C metsotso e le 30. Vortex sampole gape mme o fuduwe ka +4°C metsotso e le 30. Sampole e ne ya centrifuged ka 21,000 g metsotso e le 5 ka 4°C, mme morago ga moo supernatant e e neng ya tswa e ne ya kokoanngwa le go omisiwa go dirisiwa setlhotlheletsi sa SpeedVac ka 25°C go sekasekwa morago ga moo. Jaaka go tlhalositswe fa godimo, tshekatsheko ya LC-MS e ne ya dirwa mo diaminoesiti tsa disele tse di tlhophilweng. Ka go dirisa TraceFinder (mofuta wa 4.2, Thermo Fisher ya Saense), tshekatsheko ya tshedimosetso e ne ya dirwa ka go dirisa bokete jwa monoisotopic jwa motswako mongwe le mongwe. Go tlwaelega ga tshedimosetso ya metabolite go ne ga dirwa ka go dirisa sephuthelwana sa sofotewere ya preprocessCore (57).
Go baakanyetsa selae. Peba e ne ya bolawa ke khabonetaeokosaete ka bonako mme ya kgaolwa tlhogo, boboko bo ne jwa ntshiwa ka bonako mo legatleng, mme go ne ga dirisiwa thipa e e roromang e e tletseng aese (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Jeremane) go e sega go nna dikarolo tsa khabonetaeokosaete tsa 300 go ya go 375 μm sa5d. CO2) Ca2 + ACSF e e kwa tlase (NaCl ya 125,0 mM, KCl ya 2,5 mM, sethibela-fosefeite sa sodiamo sa 1,25 mM, NaHCO3 ya 25,0 mM, d-sukiri ya 25,0 mM, CaCl2 ya 1,0 mM le Adju go ya go pH30 ya 6,0 mM. mOsm). Fetisetsa diselaese tsa boboko tse di bonweng mo phaposing e e nang le Ca2 + ACSF e e kwa godimo (NaCl ya 125.0 mM, KCl ya 2.5 mM, sethibela-mafura sa fosefeite sa sodiamo sa 1.25 mM, NaHCO3 ya 25.0 mM, d-glucose ya 25.0 mM ya pH2l2l le 4.0 mM ya Ca5C. le 310 go ya go 320 mOsm). Boloka diselaese metsotso e le 20 go ya go e le 30 gore di kgone go busediwa pele ga o rekota.
go rekota. Sethala sa maekerosekopo se se nang le phaposi e e tlhomameng ya go rekota le lense ya maikaelelo a go inela mo metsing ya 20x (Scientifica) se ne sa dirisiwa mo dikgatisong tsotlhe. Disele tsa Purkinje tse di akanngwang di ne tsa supiwa ka (i) bogolo jwa mmele, (ii) lefelo la mmele la cerebellum, le (iii) go tlhagisiwa ga jini ya mmegadikgang ya mtYFP e e phatsimang. Pipete ya patch e e nang le kganetso ya ntlha ya di-megohm di le 5 go ya go di le 11 e gogwa ke mothapo wa galase wa borosilicate (GB150-10, 0.86 mm×1.5 mm×100 mm, Ditlhagiswa tsa Saense, Hofheim, Jeremane) le pipete e e rapaletseng ya Didiriswa tsa Sup. Dikgatiso tsotlhe di ne di dirwa ke segodisi sa ELC-03XS npi sa tlelampe ya tlelampe (npi ya eleketeroniki GmbH, Tam, Jeremane), e e neng e laolwa ke serweboleta sa Signal (mofuta wa 6.0, Eleketeroniki ya Cambridge, Cambridge, UK). Tekeletso e ne ya kwalwa ka seelo sa go tsaya disampole sa 12.5 kHz. Letshwao le sefa le tse peli tse khutšoanyane-feta Bessel ditlhotlhi le cutoff maqhubu a 1.3 le 10 kHz ka ho latellana. The capacitance ya lera le pipette e puseletso ke puseletso potoloho sebedisa seholisa-modumo. Diteko tsotlhe di ne tsa dirwa ka fa tlase ga taolo ya khamera ya Orca-Flash 4.0 (Hamamatsu, Gerden, Jeremane), e e neng e laolwa ke sofotewere ya Hokawo (mofuta wa 2.8, Hamamatsu, Gerden, Jeremane).
Thulaganyo le tshekatsheko ya sele yotlhe ya ka metlha. Fela pele ga go rekota, tlatsa pipette ka tharabololo ya ka fa gare e e nang le dilo tse di latelang: 4.0 mM KCl, 2.0 mM NaCl, 0.2 mM EGTA, 135.0 mM potasiamo gluconate, 10.0 mM Hepes, 4.0 mM Guphano. (Na) le 10.0 mM ya fosefeite ya creatinine di ne tsa fetolelwa go pH 7.25, mme kgatelelo ya osmotic e ne e le 290 mOsm (sucrose). Fela morago ga go dirisa maatla a 0 pA go thuba lera, bokgoni jwa lera le le ikhutsitseng bo ne jwa lekanngwa. Kganetso ya tsenyo e lekanngwa ka go dirisa metsi a a feteletseng a -40, -30, -20, le -10 pA. Lekanya bogolo jwa karabelo ya motlakase mme o dirise molao wa Ohm go bala kganetso ya tsenyo. Tiro e e itiragaletseng fela e ne ya kwalwa mo tlelapong ya motlakase metsotso e le 5, mme sPSC e ne ya supiwa le go lekanngwa mo Igor Pro (mofuta wa 32 7.01, WaveMetrics, Letsha la Oswego, Oregon, USA) go dirisiwa sekwalwa sa go lemoga se se itirisang. The IV sebopeho le tsitsitseng-boemo jwale di lekanngwa ka clamping leshala ka bokgoni bo fapaneng (ho qala ho tloha -110 mV) le ho eketsa gagamalo ka 5 mV dikgato. Tlhagiso ya AP e ne ya lekwa ka go dirisa motlakase wa depolarizing. Tlhoma sele ka -70 mV fa o ntse o dirisa go itaya ga motlakase o o depolarizing. Fetola boholo ba kgato ya yuniti e nngwe le e nngwe ya ho rekota ka thoko (10 ho isa ho 60 pA). Balela makhubu a a kwa godimo a AP ka go bala ka seatla ditlhako tsa go itaya ga pelo tse di bakang makhubu a a kwa godimo a AP. Monyako wa AP o sekasekwa ka go dirisa setswakwa sa bobedi sa pulse ya depolarization e e tlhotlheletsang pele AP e le nngwe kgotsa go feta.
Perforated patch thulaganyo le tshekatsheko. Dira rekoto ya patch e e phunyeleditsweng o dirisa diporothokholo tse di tlwaelegileng. Dirisa pipete e e senang ATP le GTP e e senang metswako e e latelang: 128 mM ya gluconate K, 10 mM ya KCl, 10 mM ya Hepes, 0.1 mM ya EGTA le 2 mM ya MgCl2, mme o fetole go pH 7.2 (o dirisa KOH). ATP le GTP di tlogetswe mo tharabololong ya intracellular go thibela go tsenelela go go sa laolegeng ga lera la sele. Pipete ya setlhare e tladiwa ka tharabololo ya ka fa gare e e nang le amphotericin (e e ka nnang 200 go ya go 250 μg/ml; G4888, Sigma-Aldrich) go bona rekoto ya setlhare se se phunyeleditsweng. Amphotericin e ne e qhibidiha ka dimethyl sulfoxide (boemo ba ho qetela: 0.1 ho isa ho 0.3%; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich). Mothamo wa DMSO o o dirisitsweng ga o a ka wa nna le phelelo epe e e bonalang mo di-neuron tse di ithutilweng. Nakong ya tshebetso ya ho phunya, kganetso ya kanale (Ra) e ne e ntse e bewa leihlo, mme teko e ile ya qala ka mora hore bophahamo ba Ra le AP bo tsitsitse (metsotso e 20-40). Tiro e e itiragalelang fela e lekanyediwa mo tlelamong ya motlakase le/kgotsa motlakase metsotso e le 2 go ya go e le 5. Tshekatsheko ya tshedimosetso e ne ya dirwa go dirisiwa Igor Pro (mofuta wa 7.05.2, WaveMetrics, USA), Excel (mofuta wa 2010, Koporasi ya Microsoft, Redmond, USA) le GraphPad Prism (mofuta wa 8.1.2, Serweboleta sa GraphPad Inc., La Jolla, CA). Dinaga tsa Amerika). Gore go kgonege go lemoga di-AP tse di itiragalelang fela, go dirisiwa polaka-in ya NeuroMatic v3.0c ya IgorPro. Ka go itirisa supa di-AP o dirisa molelwane o o rileng, o o fetolwang ka bongwe mo rekotong nngwe le nngwe. O dirisa sekgala sa spike, tlhomamisa makgetlo a spike ka makgetlo a a kwa godimo a spike a ka bonako le makgetlo a spike a a magareng.
PN go itlhaola. Ka go ikamanya le porothokholo e e gatisitsweng pele, PNs e ne ya phepafadiwa go tswa mo cerebellum ya peba mo kgatong e e rileng (58). Ka bokhutshwane fela, boboko jo bo botlana bo ne jwa kgaoganngwa le go silwa mo sedirisiweng se se tsididi jaaka aese sa go kgaogana [kwantle ga HBSS Ca2+ le Mg2+, bo tlaleleditswe ka sukiri ya 20 mM, penisilini (50 U/ml) le streptomycin (0.05 mg/ml) [], mme morago ga moo ga tlalelediwa sedirisiwa seno ka mgSS1, papal1. / ml), papaine (16 U / ml) le deoksiribonuklease I (DNase I; 0.1 mg/ml)] Alafa metsotso e le 30 ka 30°C. Sa ntlha tlhatswa dithishu mo sedirisiweng sa HBSS se se nang le mamina a lee (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml) le DNase (0.1 mg/ml) mo themphereitšheng ya phaposi go thibela tshilo ya dijo ya enzymatic, mme morago ga moo mo sedirisiweng sa HBSS se se nang le 20 mM ya sukiri (HBmylm5), go sila ka bonolo mo HBmyl5. (0,05 mg/ml) le DNase (0,1 mg/ml) di golola disele tse di nosi. Go emisiwa ga disele go go neng ga tswa go ne ga sefiwa ka setlhotlhi sa disele sa 70μm, morago ga moo disele di ne tsa tlhotlhorwa ka dipelete ka go di tlhotlhora (1110 rpm, metsotso e le 5, 4°C) mme tsa emisiwa gape mo sedirisiweng sa go tlhaola [HBSS, e e tlaleleditsweng ka 20 mM ya sukiri, 20% ya streetmylin ya lesea le le mo popelong) Serum, 20. (0,05 mg/ml)]; sekaseka go kgona ga disele ka propidium iodide le go fetola kitlano ya disele go nna disele di le 1 × 106 go ya go di le 2 × 106/ml. Pele ga cytometry ya kelelo, go emisiwa go ne ga sefiwa ka sefepi sa sele sa 50 μm.
Saetometara ya kelelo. Go tlhaola disele go ne ga dirwa kwa 4°C go dirisiwa motšhini wa FACSAria III (Disaense tsa Ditshedi tsa BD) le serweboleta sa FACSDiva (Disaense tsa Ditshedi tsa BD, mofuta wa 8.0.1). The sele ho fanyeha e ne e hlophisitswe ho sebelisa 100 μm nozzle tlas'a kgatello ea 20 psi ka sekgahla sa ~ 2800 liketsahalo / sec. Kaha ditlhoko tsa setso tsa ho kenya (boholo ba sele, kgethollo ya bimodal, le dipharologantsho tsa ho hasana) di ke ke tsa netefatsa ho arohanngwa ho nepahetseng ha PN ho mefuta e meng ya disele, leano la ho kenya le behilwe ho ipapisitswe le papiso e tobileng ya matla a YFP le autofluorescence ho mitoYFP + le taolo ya MitoYFP − mitoYFP. YFP e thabile ka ho phatlalatsa sampole ka mola wa laser wa 488 nm, mme letshwao le lemohuwa ka ho sebedisa sefepi sa ho feta sa 530/30 nm. Mo dipebeng tsa mitoYFP +, maatla a a amanang a jini ya mmegadikgang ya Rosa26-mitoYFP le one a dirisiwa go farologanya mmele wa disele tsa boboko le dikarolwana tsa axon. 7-AAD e thabile ka laser e tshehla ya 561 nm mme e lemogwa ka setlhotlhi sa bandpass sa 675/20 nm go kgaphela kwa thoko disele tse di suleng. Gore go kgaoganngwe di-astrocyte ka nako e le nngwe, go emisiwa ga sele go ne ga tshasiwa ka ACSA-2-APC, morago ga moo sampole e ne ya phatsimisiwa ka mola wa laser wa 640 nm, mme go ne ga dirisiwa setlhotlhi sa bandpass sa 660/20 nm go lemoga letshwao.
Disele tse di kgobokantsweng di ne tsa tsenngwa di-pellet ka go di tlhotlhora (1110 rpm, metsotso e le 5, 4°C) mme tsa bolokwa kwa -80°C go fitlha di dirisiwa. Dipeba tsa Mfn2cKO le dintšanyana tsa tsona tsa matlakala di aroganngwa ka letsatsi le le lengwe go fokotsa go fetoga ga tsamaiso. Tlhagiso ya tshedimosetso ya FACS le tshekatsheko di ne tsa dirwa go dirisiwa serweboleta sa FlowJo (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, USA).
Jaaka go umakilwe fa godimo (59), PCR ya nako ya nnete e dirisiwa go kgaoganya DNA go tswa mo di-neuron tse di tlhophilweng gore go dirwe selekanyo sa mtDNA morago ga moo. The linearity le monyako kutloisiso ba ne ba qalong lekoa ka ho matha qPCR ka palo e fapaneng ya disele. Ka bokhutshwane, kokoanya 300 PN mo sethibelong sa go tlhatswa se se nang le tris-HCl ya 50 mM (pH 8.5), EDTA ya 1 mM, Tween 20 ya 0.5% le poroteinase K (200 ng/ml) mme o e tlhotlheletse ka 55°C metsotso e le 120. Disele di ne tsa tlhokomelwa gape ka 95°C metsotso e le 10 go netefatsa gore proteinase K ga e dire gotlhelele. Saense, nomoro ya lenaane la dijini Mm04225274_s1), mt-Nd6 (Saense ya Thermo Fisher, nomoro ya lenaane la dijini AIVI3E8) le 18S (Saense ya Thermo Fisher, nomoro ya lenaane la dijini Hs99999901_s1).
Go baakanyetsa sampole ya proteome. Ka go gotetsa tharabololo ka 95°C metsotso e le 10 le go e dirisa ka modumo, mo sethibelang-go lysis [6 M ya tleloraete ya guanidine, 10 mM ya tris (2-carboxyethyl) haeterokoloraete ya fosfin, 10 mM ya tleloroasetamide le 100 mM ya tris-HC Lyse mo nyuroneng e e gatseditsweng]. Ka Bioruptor (Diagenode) metsotso e le 10 (metsotswana e le 30 ya go itaya ga pelo / nako ya go ema ya metsotswana e le 30). Sampole e ne ya tlhaolosiwa ka 1:10 mo tris-HCl ya 20 mM (pH 8.0), ya tlhakanngwa le 300 ng ya gauta ya trypsin (Promega), mme ya tlhokomelwa bosigo jotlhe ka 37°C go fitlhelela tshilo e e feletseng. Ka letsatsi la bobedi, sampole e ne ya centrifuged ka 20,000 g metsotso e le 20. Supernatant e ne ya tlhaolosiwa ka 0.1% ya formic acid, mme tharabololo e ne ya tlosiwa letswai ka StageTips e e itiretsweng. Sampole e ne ya omisiwa mo sedirisweng sa SpeedVac (setlhotlheletsi sa Eppendorf mmogo le 5305) ka 45°C, mme morago ga moo peptide e ne ya emisiwa mo esiti ya formic ya 0.1%. Disampole tsotlhe di ne tsa baakanngwa ka nako e le nngwe ke motho a le mongwe. Gore go sekasekwe disampole tsa disele tsa dinaledi, dipeptide tsa 4 μg tse di ntshitsweng letswai di ne tsa tshwaiwa ka theke ya bokete jwa tandem (TMT10plex, nomoro ya lenaane la disele 90110, Thermo Fisher Scientific) ka selekanyo sa peptide go ya go sediriswa sa TMT sa 1:20. Bakeng sa ho tshwaya TMT, 0.8 mg ya sediriswa sa TMT e ne ya tlhongwa gape mo 70 μl ya ACN e e senang metsi, mme peptide e e omisitsweng e ne ya bopiwa sešwa go nna 9 μl ya 0.1 M TEAB (triethylammonium bicarbonate), e mo go yona go neng ga okediwa ka 7 μl ya sediriswa sa TMT mo ACN. The mahloriso e ne e le 43.75%. Morago ga metsotso e le 60 ya go tlhoga, tsibogo e ne ya timiwa ka 2 μl ya 5% hydroxylamine. Dipeptide tse di tshwailweng di ne tsa kokoanngwa, tsa omisiwa, tsa tlhongwa gape mo 200μl ya 0.1% ya formic acid (FA), tsa kgaoganngwa ka bobedi, mme tsa ntshiwa letswai go dirisiwa StageTips e e itiretsweng. Ka go dirisa khromatokerafo ya seedi ya UltiMate 3000 e e dirang sentle thata (kromatokerafo ya seedi ya UltiMate 3000), nngwe ya dihalofo tse pedi e ne ya kgaoganngwa mo kholomong ya Acquity ya 1mm x 150mm e e neng e tletse ka dikarolwana tsa C18 tsa 130Å1.7μm (NoWaters, catalog150). Thermo Fisher ya Saense). Kgaoganya dipeptide ka seelo sa kelelo sa 30μl/motsotso, kgaoganya go tswa go 1% go ya go 50% ya buffer B metsotso e le 85 ka mothalo wa dikgato wa metsotso e le 96, go tswa go 50% go ya go 95% buffer B metsotso e le 3, morago ga moo metsotso e le 8 go 95 % Buffer B; Sethibela A ke 5% ACN le 10 mM ya amoniamo bikhaboneite (ABC), mme sethibela B ke 80% ACN le 10 mM ABC. Bokella dikarolwana metsotso e meng le e meng e 3 mme o di kopanye ka dihlopha tse pedi (1 + 17, 2 + 18, jj.) mme o di omise ka centrifuge ya vacuum.
Tshekatsheko ya LC-MS/MS. Bakeng sa sepektherometri sa boima, dipeptide (nomoro ya r119.aq) di ile tsa arolwa ka kholomo ya tshekatsheko ya PicoFrit ya bophara ba ka hare ba 25 cm, 75 μm (lense e ntjha ya sepheo, nomoro ya karolo PF7508250) e nang le 1.9 μm ya ReproSil-Pur Crse, 120 μm. EASY-nLC 1200 (Saense ya Motshwaraditlhapi wa Mogote, Jeremane). Kholomo e ne e bolokwa ka 50°C. Dibuffer A le B ke 0.1% ya esiti ya formiki mo metsing le 0.1% ya esiti ya formiki mo 80% ya ACN, ka go latelana. Dipeptide di ne tsa kgaoganngwa ka mothalo wa dikgato wa 200 nl/motsotso go tswa go 6% go ya go 31% ya sethibela B metsotso e le 65, le go tswa go 31% go ya go 50% ya sethibela B metsotso e le 5. Dipeptide tse di tlhotlhilweng di ne tsa sekasekwa mo sepekterometareng sa bokete jwa Orbitrap Fusion (Saense ya Thermo Fisher). Tekanyo ya m/z ya setlhogo sa peptide e dirwa ka tharabololo ya 120,000 mo selekanyong sa 350 go ya go 1500 m/z. Ho sebedisa 27% tlwaelehileng thulano matla, matla ka ho fetisisa precursor le qoso boemo ba 2 ho 6 e kgethwa bakeng sa matla a phahameng C serai dissociation (HCD) cleavage. Nako ya modikologo e setilwe go 1 s. Boleng jwa m/z jwa karolwana ya peptide bo ne jwa lekanngwa mo seraing sa ion go dirisiwa setlhogo se sennye sa AGC sa 5 × 104 le nako e e kwa godimo ya go tlhaba ya 86 ms. Morago ga go kgaoganngwa, setlhogo se ne sa bewa mo lenaaneng la go kgaphelwa thoko le le maatla ka 45 s. Dipeptide tse di tshwailweng ka TMT di ne tsa kgaoganngwa mo kholomong ya Acclaim PepMap ya boleele jwa 50 cm, 75 μm (Thermo Fisher Scientific, nomoro ya lenaane la ditshedi 164942), mme mebalabala ya go fuduga e ne ya sekasekwa mo sebopegong sa bokete sa Orbitrap Lumos Tribrid jaaka mebalabala ya bokete ya Orbitrap Lumos Tribrid (Thermo Fisher Saense ya Saense ya Di-Wathfield e e kwa godimo) (FAIMS) thepa (Thermo Fisher Saense) sebetsa ka tse peli puseletso gagamalo tsa −50 le −70 V. MS3 khethiloeng e thehiloeng ho nyalanya pele e sebediswa bakeng sa TMT tlaleho Ion letshwao tekanyo. Kgaoganyo ya dipeptide e ne ya dirwa mo EASY-nLC 1200, go dirisiwa 90% ya elution ya mola, ka kgobokano ya buffer ya 6% go ya go 31%; sethibela A e ne e le 0.1% FA, mme sethibela B e ne e le 0.1% FA le 80% ACN. Kholomo ya tshekatsheko e dirisiwa ka 50°C. Dirisa FreeStyle (mofuta wa 1.6, Thermo Fisher ya Saense) go kgaoganya faele ya ntlha go ya ka maatla a pusetso a FAIMS.
Go supa poroteine ​​le go e lekanya. Ka go dirisa enjene ya patlo ya Andromeda e e kopantsweng, tshedimosetso ya ntlha e ne ya sekasekwa ka go dirisa mofuta wa MaxQuant wa 1.5.2.8 (https://maxquant.org/). Mo godimo ga tatelano ya Cre recombinase le YFP e e bonweng go tswa kwa Aequorea victoria, go ne ga batliwa di-spectra tsa dikarolwana tsa dipeptide go bona tatelano ya kanoniki le tatelano ya isoform ya poroteine ​​ya tshupiso ya peba (ID ya Proteome UP000000589, e e laisolotsweng go tswa go UniProt ka Motsheganong20. Okisijene ya methionine le acetylation ya poroteine ​​ya N-theminale di ne tsa bewa jaaka diphetogo tse di farologaneng; methylation ya cysteine ​​e ne e behilwe e le diphetolo tse tsitsitseng. The tshilo ya dijo ditekanyetso di behilwe ho "itseng" le "trypsin / P". Palo e e kwa tlase ya dipeptide le dipeptide tsa legare tse di dirisiwang go supa poroteine ​​ke 1; palo e e kwa tlase ya dipeptide tse di kgethegileng ke 0. Mo maemong a go tshwantshanya mmapa wa dipeptide, seelo sa go supa poroteine ​​e ne e le 0.01. Kgetho ya “Peptide ya Bobedi” e kgontshitswe. Dirisa kgetho ya “tshwano magareng ga mabelo” go fetisa ditshupo tse di atlegileng magareng ga difaele tse di farologaneng tsa ntlha. Dirisa palo ya bonnye jwa tekanyetso ya LFQ 1 go dira tekanyetso e e senang leibole (LFQ) (60). The LFQ matla e sefa bakeng sa bonyane tse peli tse sebetsang boleng ka bonyane sehlopha se le seng sa genotype ka nako e nngwe le e nngwe, 'me e extrapolated ho tloha kabo e tlwaelehileng le bophara ba. 0.3 mme o ye kwa tlase ka 1.8. Dirisa polatefomo ya dikhomphiutha ya Perseus () le R go sekaseka dipholo tsa LFQ. A tse peli-tsela itekanetseng t teko ho tloha limma Software sephuthelwana e ne e sebediswa bakeng sa phapang poleloana e reng and analysis (61). Tshekatsheko ya tshedimosetso ya go tlhotlhomisa e dirwa ka go dirisa ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally le pheatmap. Tshedimosetso ya diporoteomiki e e theilweng mo TMT e ne ya sekasekwa go dirisiwa mofuta wa MaxQuant wa 1.6.10.43. Batla tshedimosetso ya proteomics e e tala go tswa mo polokelotshedimosetsong ya proteomics ya batho ya UniProt, e e neng ya laisololwa ka Lwetse 2018. Tshekatsheko e akaretsa ntlha ya paakanyo ya bophepa jwa isotope e e tlametsweng ke modiri. Dirisa limma mo R go sekaseka tlhagiso ya pharologano. Tshedimosetso ya ntlha, dipholo tsa patlo ya polokelotshedimosetso, le kelelo ya tiro ya tshekatsheko ya tshedimosetso le dipholo tsotlhe di bolokilwe mo kgolaganong ya ProteomeXchange ka polokelo ya molekane wa PRIDE e e nang le sesupo sa sete ya tshedimosetso PXD019690.
Ditshwaelo tse di dirang di humisa tshekatsheko. Sediriswa sa Tshekatsheko ya Tsela ya Botlhale (QIAGEN) se ne sa dirisiwa go bona khumo ya mareo a tshwaelo e e dirang ya sete ya tshedimosetso mo dibekeng tse 8 (Setshwantsho 1). Ka bokhutshwane, lenaane la diporoteine ​​tsa bontsi le le bonweng go tswa mo tshekatshekong ya tshedimosetso ya LC-MS/MS (tandem mass spectrometry) le dirisiwa ka dikelo tse di latelang tsa setlhotlhi: Mus musculus e tlhophilwe jaaka mofuta le lemorago, mme setlhopha se bontsha boleng jwa P jo bo fetotsweng ke Benjamini go humisa 0.05 kgotsa kwa tlase bo tsewa bo le botlhokwa. Bakeng sa kerafo ena, dihlopha tse hlano tse hodimo tse feteletseng sehlopheng se seng le se seng tse thehilweng hodima boleng ba P bo fetotsweng di bontshitswe. Ho sebedisa t-teko e ngata, ho sebedisa lenaneo la ho matlafatsa la dikgato tse pedi la Benjamini, Krieger, le Yekutieli (Q = 5%), tlhahlobo ya tlhaloso ya protheine ya nako e etswa ho bonkgetheng ba bohlokwa ba supilweng sehlopheng se seng le se seng, mme mola o mong le o mong o sekasekwa ka thoko. Ga go tlhokege go amogela SD e e tlhomameng.
Gore re kgone go bapisa dipholo tsa thutopatlisiso eno le dipolokelotshedimosetso tse di gatisitsweng le go tlhagisa setshwantsho sa Venn mo Setshwantshong 1, re ne ra kopanya lenaane la diporoteine ​​tsa bontsi le ditshwaelo tsa MitoCarta 2.0 (24). Dirisa sediriswa sa mo inthaneteng Thala Tayakeramo ya Venn (http://tshedimosetso ya ditshedi.
Go bona tshedimosetso e e feletseng ka ga ditsamaiso tsa dipalopalo tse di dirisiwang mo tshekatshekong ya proteomics, tsweetswee leba karolo e e tsamaelanang ya Didirisiwa le Mekgwa. Bakeng sa diteko tse ding tsohle, tlhahisoleseding e qaqileng e ka fumanwa tlwaelo e tsamaellanang. Ntle le fa go tlhalositswe ka tsela e sele, tshedimosetso yotlhe e tlhagisiwa jaaka palogare ± SEM, mme ditshekatsheko tsotlhe tsa dipalopalo di dirilwe go dirisiwa sofotewere ya GraphPad Prism 8.1.2.
Go bona didirisiwa tsa tlaleletso tsa setlhogo seno, tsweetswee leba http://advances.sciencemag.org/cgi/diteng.
Seno ke setlhogo se se bulegileng se se anamisiwang ka fa tlase ga melawana ya Laesense ya Creative Commons Attribution-Non-Commercial, e e letlang tiriso, go anamisiwa le go gatisiwa gape ka sedirisiwa sepe fela, fa fela tiriso ya bofelo e se ya go bona dipoelo tsa kgwebo mme ntlha e le gore tiro ya ntlha e nepagetse. Tshupetso.
Ela tlhoko: Re go kopa fela gore o neele aterese ya gago ya imeile gore motho yo o mo akantshang mo tsebeng a itse gore o batla gore a bone imeile le gore ga se sepamo. Ga re na go tsaya diaterese dipe tsa imeile.
Potso eno e dirisiwa go leka gore a o moeng le go thibela thomelo ya sepamo ka go itirisa.
Ka E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Larson
Tshekatsheko ya proteomics ya di- neuron tse di sa direng sentle e ne ya senola gore dithulaganyo tsa metaboliki di a dirisiwa go lwantsha go senyega ga di- neuron.
Ka E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Larson
Tshekatsheko ya proteomics ya di- neuron tse di sa direng sentle e ne ya senola gore dithulaganyo tsa metaboliki di a dirisiwa go lwantsha go senyega ga di- neuron.
©2020 Mokgatlho wa Amerika wa Kgatelopele ya Saense. ditshwanelo tsotlhe di beilwe. AAAS ke molekane wa HINARI, AGORA, OARE, KHORASE, CLOCKSS, CrossRef le COUNTER. Dikgatelopele tsa Saense ISSN 2375-2548.