Re lebogela go bo o etetse Nature.com. Mofuta wa sebatli se o se dirisang o na le tshegetso e e lekanyeditsweng ya CSS. Gore o bone dipholo tse di molemo, re akantsha gore o dirise mofuta o mosha wa sebatli sa gago (kgotsa o thibele Mokgwa wa go Tshwaragana mo Internet Explorer). Fa re sa ntse re letile, go tlhomamisa gore re nna re tshegetsa, re bontsha saete kwantle ga go dira setaele kgotsa JavaScript.
Propionic acid (PPA) e dirisiwa go ithuta seabe sa go sa dire sentle ga mitochondrial mo mathateng a tlhabololo ya methapo a a jaaka bolwetse jwa autism spectrum. PPA e itsege ka go kgoreletsa go tlhamiwa ga ditshedi tsa mitochondrial, go fetoga ga dijo le go fetoga ga ditshedi. Le fa go ntse jalo, ditlamorago tsa PPA mo diphetogong tsa mitochondrial, go kgaogana le go kopana ga tsone di sa ntse di le mathata ka ntlha ya go raraana ga mekgwa eno ya nakwana. Mona, re sebedisa mekgwa e tlatsetsang ya ho nka ditshwantsho tsa bongata ho batlisisa kamoo PPA e amang kateng sebopeho sa mitochondrial, sebopeho, le matla a disele tsa SH-SY5Y tse kang di-neuron. PPA (5 mM) e bakile phokotsego e e bonalang ya lefelo la mitochondrial (p <0.01), molagare wa Feret le modikologo (p <0.05), le lefelo la 2 (p <0.01). Tshekatsheko ya locator ya tiragalo ya mitochondrial e bontshitse koketsego e e bonalang (p <0.05) mo ditiragalong tsa go kgaoga le go kopana, ka jalo go boloka bothokgami jwa mafaratlhatlha a mitochondrial mo maemong a kgatelelo ya maikutlo. Mo godimo ga moo, tlhagiso ya mRNA ya cMYC (p <0,0001), NRF1 (p <0,01), TFAM (p <0,05), STOML2 (p <0,0001) le OPA1 (p <0,05) e ne ya fokodiwa thata. 01). Seno se bontsha go bopiwa sešwa ga popego ya mitochondrial, biogenesis le diphetogo go tshegetsa tiro mo maemong a kgatelelo ya maikutlo. Dintlha tsa rona di fana ka kutlwisiso e ntjha ya ditlamorao tsa PPA ho matla a mitochondrial le ho totobatsa tshebediso ya mekgwa ya ho nka ditshwantsho bakeng sa ho ithuta mekgwa e rarahaneng ya taolo e amehang dikarabong tsa kgatello ya mitochondrial.
Mitochondria ke batsayakarolo ba botlhokwa mo ditirong tse di farologaneng tsa disele go feta dikarolo tsa bone tse di tlwaelegileng mo tlhagisong ya maatla le mo go tlhameng ditshedi. Metabolism ya mitochondrial ke molaodi wa konokono wa go ntsha matshwao a khalesiamo, metaboliki le redox homeostasis, go ntsha matshwao a go ruruga, diphetogo tsa epigenetic, go ata ga disele, go farologana le loso lwa disele lo lo rulagantsweng1. Ka ho khetheha, metabolism ya mitochondrial e bohlokwa bakeng sa ntshetsopele ya di-neuron, ho pholoha le tshebetso mme e ameha haholo diponahalong tse fapaneng tsa bolwetse ba methapo2,3,4.
Mo dingwageng di le lesome tse di fetileng, maemo a metaboliki a tlhageletse jaaka molaodi wa botlhokwa wa neurogenesis, pharologano, go butswa le go nna polasetiki5,6. Bosheng jaana, popego ya di-mitochondria le go fetoga ga tsone e nnile dikarolo tse di botlhokwa thata tsa mitosis, e leng thulaganyo e e fetogang e e bolokang letamo la di-mitochondria tse di itekanetseng mo teng ga disele. Diphetogo tsa di-mitochondria di laolwa ke ditsela tse di raraaneng tse di ikaegileng ka tse dingwe go simolola ka go tlhamiwa ga di-mitochondria le go nna le maatla a di-mitochondria go ya kwa go kgaoganeng ga di-mitochondria, go kopana ga di-mitochondria, go di tsamaisa le go di tlosa7,8. Go kgoreletsega ga epe ya mekgwa eno e e kopanyang go kgoreletsa go tlhokomelwa ga dineteweke tse di itekanetseng tsa mitochondrial mme go na le ditlamorago tse di tseneletseng tsa go dira mo tlhabololong ya methapo9,10. Ee, go sa laolegeng ga diphetogo tsa mitochondrial go lemogiwa mo malwetseng a mantsi a tlhaloganyo, a go senyega ga methapo le a go gola ga methapo, go akaretsa le mathata a autism spectrum (ASD)11,12.
ASD ke bolwetse jo bo sa tshwaneng jwa tlhabololo ya methapo jo bo nang le thulaganyo e e raraaneng ya dijini le tsa epigenetic. Ga go ganetsanwe gore ASD e ka ruiwa, mme ga go ise go tlhaloganngwe sentle gore ke eng se se bakang ASD. Go kokoanya tshedimosetso go tswa mo dikaong tsa pele ga kalafi, dithuto tsa kalafi, le ditlhopha tsa tshedimosetso tsa dimolekhule tsa di-omics tse dintsi go tlamela ka bosupi jo bo oketsegang jwa go sa dire sentle ga mitochondrial mo ASD13,14. Re kile ra dira sekerini sa methylation ya DNA e e akaretsang jenome mo setlhopheng sa balwetse ba ba nang le ASD mme ra supa dijini tse di methylated ka go farologana tse di kgobokaneng mo ditseleng tsa metaboliki tsa mitochondrial15. Re ne ra bega ka methylation e e farologaneng ya balaodi ba ba fa gare ba biogenesis le diphetogo tsa mitochondrial, e e neng e amana le palo e e oketsegileng ya dikhopi tsa mtDNA le porofaele e e fetotsweng ya metaboliki ya motlhapo mo ASD16. Tshedimosetso ya rona e naya bosupi jo bo oketsegang jwa gore diphetogo tsa mitochondrial le homeostasis di na le seabe se se botlhokwa mo thutong ya malwetse a ASD. Ka jalo, go tokafatsa go tlhaloganya kamano fa gare ga diphetogo tsa mitochondrial, popego ya tsone le tiro ya tsone ke mokgele o mogolo wa patlisiso e e tswelelang pele ya malwetse a methapo a a tlhaolwang ke go sa dire sentle ga mitochondrial ga bobedi.
Mekgwa ya dimolekhule gantsi e dirisiwa go ithuta seabe sa dijini tse di rileng mo dikarabong tsa kgatelelo ya mitochondrial. Le fa go ntse jalo, mokgwa ono o ka nna wa lekanyediwa ke go nna le dikarolo tse dintsi le tsa nakwana ga mekgwa ya taolo ya mitotic. Mo godimo ga moo, go tlhagisiwa ga dijini tsa mitochondrial ka go farologana ke sesupo se se sa tlhamalalang sa diphetogo tse di dirang, segolobogolo ka gonne ka tlwaelo go sekasekwa fela palo e e lekanyeditsweng ya dijini. Ka jalo, go tshitshintswe mekgwa e e tlhamaletseng ya go ithuta tiro ya mitochondrial le di-bioenergetics17. Popego ya di-mitochondria e amana thata le diphetogo tsa di-mitochondria. Sebopego sa mitochondrial, kgolagano, le popego di botlhokwa thata mo tlhagisong ya maatla le mo go tsheleng ga mitochondrial le disele5,18. Ho feta moo, dikarolo tse fapaneng tsa mitosis di tsepamisitse maikutlo diphetohong tsa sebopeho sa mitochondrial, tse ka nnang tsa sebetsa e le dintlha tse mosola tsa ho se sebetse ha mitochondrial mme tsa fana ka motheo wa dithuto tse latelang tsa metjhini.
Popego ya mitochondrial e ka lemogwa ka tlhamalalo ka go dirisa maekerosekopo ya eleketeroniki ya phetiso (TEM), e letla thuto e e tseneletseng ya popego ya disele. TEM e bona ka tlhamalalo popego, popego le popego ya di-cristae tsa mitochondrial ka tharabololo ya di-mitochondria ka bongwe, go na le go ikaega fela ka go kwalololwa ga dijini, go tlhagisiwa ga diporoteine ​​kgotsa dipharametara tsa tiro ya mitochondrial mo ditlhopheng tsa disele17,19,20. Mo godimo ga moo, TEM e dira gore go kgonege go ithuta ditirisano fa gare ga di-mitochondria le di-organel tse dingwe, tse di jaaka reticulum ya endoplasmic le di-autophagosome, tse di nang le seabe se se botlhokwa mo tirong ya di-mitochondria le mo go nneng teng ga ditshedi tse dingwe. Ka jalo, seno se dira gore TEM e nne tshimologo e e siameng ya go ithuta ka go sa dire sentle ga mitochondria pele ga go tlhoma mogopolo mo ditseleng tse di rileng kgotsa mo dijining. Jaaka fa tiro ya mitochondrial e ntse e nna maleba thata mo thutong ya malwetse a methapo, go na le tlhokego e e bonalang ya go kgona go ithuta ka tlhamalalo le ka bontsi popego ya mitochondrial le diphetogo tsa yone mo dikaong tsa disele tsa methapo tsa in vitro.
Mo setlhogong seno, re sekaseka diphetogo tsa di-mitochondria mo sekaong sa disele tsa boboko sa go sa dire sentle ga di-mitochondria mo bolwetseng jwa autism. Re kile ra bega ka methylation e e farologaneng ya propionyl-CoA carboxylase beta (PCCB) mo ASD15, e leng yunitipotlana ya ensaeme ya PCC ya propionyl-CoA ya ​​khaboksilase ya mitochondrial. Go sa laolegeng ga PCC go itsege go baka go kokoanngwa ga ditswakwa tsa propionyl tse di botlhole, go akaretsa le esiti ya propionic (PPA)23,24,25. PPA e bontshitswe e kgoreletsa metabolism ya disele tsa boboko le go fetola boitshwaro mo vivo mme ke sekao sa diphologolo se se tlhomilweng sa go ithuta mekgwa ya tlhabololo ya methapo e e amegang mo ASD26,27,28. Mo godimo ga moo, PPA e begilwe gore e kgoreletsa bokgoni jwa lera la mitochondrial, go tlhamiwa ga ditshedi le go hema mo vitro mme e dirisitswe thata go dira sekao sa go sa dire sentle ga mitochondrial mo di-neuron29,30. Le fa go ntse jalo, ga go ise go tlhaloganngwe sentle kafa go sa dire sentle ga mitochondrial go go bakiwang ke PPA mo sebopegong sa mitochondrial le mo go fetogeng ga yone.
Thutopatlisiso eno e dirisa mekgwa e e tlaleletsang ya go tsaya ditshwantsho go lekanya ditlamorago tsa PPA mo sebopegong sa mitochondrial, mo diphetogong tsa yone le mo tirong ya yone mo diseleng tsa SH-SY5Y. Sa ntlha, re ne ra tlhama mokgwa wa TEM wa go bona ka leitlho la mogopolo diphetogo mo sebopegong sa mitochondrial le mo sebopegong sa tsone17,31,32. Ho ya ka tlhaho e matla ya mitochondria33, re boetse re sebedisitse tlhahlobo ya sebakeng sa ketsahalo ya mitochondrial (MEL) ho lekanya diphetoho tsa tekatekano pakeng tsa diketsahalo tsa ho arohana le tsa ho kopana, palo ya mitochondria le bophahamo ba modumo tlasa kgatello ya PPA. Kwa bofelong, re ne ra sekaseka gore a popego le diphetogo tsa di-mitochondria di amana le diphetogo mo go tlhagiseng dijini tse di amegang mo go tlhameng ditshedi, go kgaogana le go kopana. Fa di tsewa mmogo, tshedimosetso ya rona e bontsha kgwetlho ya go tlhalosa go raraana ga mekgwa e e laolang diphetogo tsa mitochondrial. Re totobatsa tiriso ya TEM mo go ithuteng popego ya mitochondrial jaaka ntlha e e ka lekanngwang ya go kopana ya mitosis mo diseleng tsa SH-SY5Y. Mo godimo ga moo, re tlhomolola gore tshedimosetso ya TEM e naya tshedimosetso e e humileng thata fa e kopanngwa le mekgwa ya go tsaya ditshwantsho e gape e tshwarang ditiragalo tse di fetofetogang go tsibogela kgatelelo ya metaboliki. Go tlhalosa gape mekgwa ya taolo ya dimolekhule e e tshegetsang mitosis ya disele tsa disele tsa boboko go ka nna ga tlamela ka temogo e e botlhokwa ka karolo ya mitochondrial ya thulaganyo ya methapo le malwetse a a senyang disele tsa boboko.
Go tlhotlheletsa kgatelelo ya mitochondria, disele tsa SH-SY5Y di ne tsa alafiwa ka PPA go dirisiwa 3 mM le 5 mM ya sodiamo propionate (NaP). Pele ga TEM, disampole di ne tsa tsenngwa mo paakanyong ya sampole ya cryogenic go dirisiwa go gatsela ga kgatelelo e e kwa godimo le go gatsela (Setshwantsho 1a). Re ntsheditse pele peipi ya tshekatsheko ya setshwantsho sa mitochondrial e e itirisang go lekanya dipharametara di le robedi tsa popego ya dipalopalo tsa mitochondrial go ralala dipoeletso tse tharo tsa ditshedi. Re fumane hore kalafo PPA haholo fetola ditekanyetso tse 'nè: sebaka 2, sebaka, moedi, le Feret bophara (Setshwantsho 1b-e). Lefelo la 2 le fokotsegile thata ka kalafi ya PPA ya 3 mM le 5 mM (p = 0.0183 le p = 0.002, ka go latelana) (Setshwantsho 1b), fa lefelo (p = 0.003), molelwane (p = 0.0106) le molagare wa Feret tsotlhe di fokotsegile thata. Ho bile le phokotso e bonahalang (p = 0.0172) sehlopheng sa kalafo sa 5 mM ha se bapisoa le sehlopha sa taolo (Setshwantsho 1c-e). Diphokotso tse di bonalang tsa lefelo le modikologo di bontshitse gore disele tse di alafilweng ka 5 mM PPA di ne di na le di-mitochondria tse dinnye, tse di kgolokwe thata, le gore di-mitochondria tseno di ne di sa lelefatsa go le kalo go feta tse di mo diseleng tsa taolo. Sena se boetse se lumellana le phokotseho e khōlō ea bophara ba Feret, paramethara e ikemetseng e bontšang phokotseho ea sebaka se seholo ka ho fetisisa pakeng tsa metshetshe ea karolwana. Diphetogo mo sebopegong se se kwa godimo sa di-cristae di ne tsa lemogwa: di-cristae di ne tsa nna tse di sa bonaleng thata ka fa tlase ga tlhotlheletso ya kgatelelo ya PPA (Setshwantsho 1a, phanele B). Le fa go ntse jalo, ga se ditshwantsho tsotlhe tse di neng di bontsha sentle popego ya di-cristae, ka jalo ga go a ka ga dirwa tshekatsheko ya dipalopalo ya diphetogo tseno. Tshedimosetso eno ya TEM e ka nna ya bontsha maemo a le mararo a a ka nnang teng: (1) PPA e tokafatsa go kgaogana kgotsa e thibela go kopana, mme seno se dira gore di-mitochondria tse di leng teng di ngotlege ka bogolo; (2) go tlhamiwa ga ditshedi go go tokafaditsweng go dira di-mitochondria tse disha, tse dinnye kgotsa (3) go dira gore go nne le mekgwa eno ka bobedi ka nako e le nngwe. Le fa maemo ano a ka se farologanngwe ka TEM, diphetogo tse di botlhokwa tsa popego di supa diphetogo mo homeostasis ya mitochondrial le diphetogo tse di ka fa tlase ga kgatelelo ya PPA. Re morago ga moo re ne ra sekaseka dipharametara tse dingwe go tlhalosa go ya pele diphetogo tseno le mekgwa e e ka nnang teng e e di dirang.
Esiti ya propionic (PPA) e fetola popego ya di-mitochondria. (a) Ditshwantsho tsa maekerosekopo ya eleketeroniki ya phetiso e e emelang (TEM) tse di bontshang gore bogolo jwa mitochondria bo a fokotsega mme di-mitochondria di nna dinnye le go nna kgolokwe fa kalafi ya PPA e ntse e oketsega; 0 mM (e e sa alafiwang), 3 mM le 5 mM, ka go latelana. Metsu e mehibidu e bontsha di-mitochondria. (b-e) Disele tsa SH-SY5Y tse alafilweng ka PPA bakeng sa 24 h di ne di lokiseditswe TEM mme diphetho di ile tsa sekasekwa ho sebediswa Fiji / ImageJ. Dipharametara tse nne tsa tse robedi di bontshitse dipharologano tse di bonalang fa gare ga disele tsa taolo (tse di sa alafiwang, 0 mM PPA) le tse di alafilweng (3 mM le 5 mM PPA). (b) Kgaolo 2, (c) Lefelo, (d) Modikologo, (e) Molagare wa Feret. Tshekatsheko ya tsela e le nngwe ya pharologano (taolo kgatlhanong le kalafi) le teko ya papiso ya bontsi ya ga Dunnett di ne tsa dirisiwa go bona dipharologano tse di botlhokwa (p <0.05). Dintlha tsa tshedimosetso di emela boleng jo bo magareng jwa mitochondrial jwa sele nngwe le nngwe ka bongwe, mme dibara tsa phoso di emela palogare ya ± SEM. Tshedimosetso e e bontshitsweng e emela n = 3, bonnye disele di le 24 ka poeletso; palogotlhe ya ditshwantsho di le 266 e ne ya sekasekwa; * e supa p < 0.05, ** e supa p < 0.01.
Go tswelela go tlhalosa kafa diphetogo tsa di-mitochondria di tsibogelang PPA ka gone, re ne ra tshasa di-mitochondria ka tetramethylrhodamine ethyl ester (TMRE) mme ra dirisa maekerosekopo ya nako le tshekatsheko ya MEL go dira gore di-mitochondria di nne tsa lefelo le le rileng le go di lekanya morago ga diura di le 24 kwa PPA ya 3 le 5 mM. Kalafo ya ditiragalo tsa fission le fusion. (Setshwantsho 2a). Morago ga tshekatsheko ya MEL, di-mitochondria di ne tsa sekasekwa gape go lekanyetsa palo ya dibopego tsa di-mitochondria le bolumu ya tsone e e magareng. Re lemogile koketsego e nnye mme e le e e botlhokwa ya palo ya ditiragalo tsa go kgaogana tse di diragalang kwa 3 mM [4.9 ± 0.3 (p <0.05)] fa di bapisiwa le go kgaogana [5.6 ± 0.3 (p <0.05) )] le go kopana [5.4 ± 0.5 (p <0.05.)] le go kopana [5.0.5 (p <0.05.)] le go kopana [5. 0.05)] <0.05)] ditiragalo di ne tsa oketsega thata ka 5 mM fa di bapisiwa le taolo (Setshwantsho 3b). Palo ya di-mitochondria e ne ya oketsega thata mo go bobedi 3 [32.6 ± 2.1 (p <0.05)] le 5 mM [34.1 ± 2.2 (p <0.05)] (Setshwantsho 3c) , fa palogare ya bolumu ya popego nngwe le nngwe ya di-mitochondria e ne e ntse e sa fetoge (Setshwantsho 1). 3d). Fa di tsewa mmogo, seno se raya gore go bopiwa sešwa ga diphetogo tsa mitochondrial go dira jaaka karabo ya pusetso e e bolokang bothokgami jwa mafaratlhatlha a mitochondrial ka katlego. Koketsego ya palo ya ditiragalo tsa go kgaogana kwa 3 mM PPA e supa gore koketsego ya palo ya mitochondrial e ka ntlha ya go kgaogana ga mitochondrial, fela ka ntlha ya gore palogare ya bolumu ya mitochondrial e nna e sa fetoge, biogenesis e ka se kgaphelwe kwa thoko jaaka karabo e e oketsegileng ya pusetso. Le fa go ntse jalo, tshedimosetso eno e tsamaisana le dibopego tse dinnye, tse di kgolokwe tsa mitochondrial tse di lemogilweng ke TEM mme gape di bontsha diphetogo tse di botlhokwa mo diphetogong tsa mitochondrial tse di tlhotlhelediwang ke PPA.
Propionic acid (PPA) e tlhotlheletsa go bopiwa sešwa ga di-mitochondria tse di maatla go boloka bothokgami jwa mafaratlhatlha. Disele tsa SH-SY5Y di ne tsa tlholwa, tsa alafiwa ka 3 le 5 mM PPA diura di le 24 mme tsa tshasiwa ka TMRE le Hoechst 33342 mme tsa latelwa ke tshekatsheko ya MEL. (a) Ditshwantsho tsa maekerosekopo tse di emelang nako tse di bontshang mmala le diponelopele tsa maatla a a kwa godimo a a kwa godimo a a kopaneng ka nako ya 2 (t2) ya boemo bongwe le bongwe. Dikgaolo tse di tlhophilweng tse di supilweng mo setshwantshong sengwe le sengwe sa bobedi di a tokafadiwa le go bontshiwa ka 3D ka diforeime tse tharo tse di farologaneng tsa nako (t1-t3) go bontsha diphetogo fa nako e ntse e tsamaya; ditiragalo tsa fusion di tlhomolotswe ka botala; ditiragalo tsa fission di tlhomolotswe ka botala. E bontshitswe ka bohibidu. (b) Palogare ya palo ya ditiragalo tse di fetogang ka maemo. (c) Palogare ya dibopego tsa mitochondrial ka sele. (d) Palogare ya bolumu (μm3) ya popego nngwe le nngwe ya mitochondrial ka sele. Tshedimosetso e e bontshitsweng e emela disele tsa n = 15 ka setlhopha sa kalafi. Dibara tsa phoso tse di bontshitsweng di emela palogare ± SEM, bara ya sekale = 10 μm, * p <0.05.
Propionic acid (PPA) e baka go gatelelwa ga dijini tse di amanang le diphetogo tsa mitochondrial. Disele tsa SH-SY5Y di ne tsa alafiwa ka 3 le 5 mM PPA ka 24 h. Go lekanyetsa dijini tse di amanang go ne ga dirwa ka go dirisa RT-qPCR mme ga tlwaelesega go nna B2M. Dijini tsa go tlhamiwa ga ditshedi tsa di-mitochondria (a) cMYC, (b) TFAM, (c) NRF1 le (d) NFE2L2. Dijini tsa go kopana le go kgaogana ga dimithokhondria (e) STOML2, (f) OPA1, (g) MFN1, (h) MFN2 le (i) DRP1. Dipharologano tse di botlhokwa (p <0.05) di ne tsa lekwa ka go dirisa ANOVA ya tsela e le nngwe (taolo kgatlhanong le kalafi) le teko ya papiso ya bontsi ya ga Dunnett: * e supa p <0.05, ** e supa p <0.01, mme **** e supa p <0.0001. Dibara di emela polelo e e magareng ± SEM. Tshedimosetso e e bontshitsweng e emela n = 3 (STOML2, OPA1, TFAM), n = 4 (cMYC, NRF1, NFE2L2), le n = 5 (MFN1, MFN2, DRP1) dipoeletso tsa ditshedi.
Tshedimosetso go tswa mo ditshekatshekong tsa TEM le MEL mmogo e supa gore PPA e fetola popego le diphetogo tsa mitochondrial. Le fa go ntse jalo, mekgwa eno ya go tsaya ditshwantsho ga e neele temogo go ya ka mekgwa e e dirang gore dithulaganyo tseno di direge. Ka jalo re ne ra sekaseka polelo ya mRNA ya balaodi ba le robongwe ba ba botlhokwa ba diphetogo tsa mitochondrial, biogenesis le mitosis go tsibogela kalafi ya PPA. Re ne ra lekanya kankere ya myeloma ya sele (cMYC), ntlha ya go hema ga nyutlea (NRF1), ntlha ya go kwalolola ya di-mitochondria 1 (TFAM), ntlha ya go kwalolola e e tshwanang le NFE2 BZIP (NFE2L2), poroteine ​​e e tshwanang le gastrin 2 (STOML2), go fokotsega ga methapo ya leitlho 1 (OPA1), (Mitofu1). poroteine ​​e e amanang le dynamin 1 (DRP1) morago ga diura di le 24 tsa kalafi ka 3 mM le 5 mM PPA. Re lemogile kalafi ya PPA ya 3 mM (p = 0,0053, p = 0,0415 le p <0,0001, ka go latelana) le 5 mM (p = 0,0031, p = 0,0233, p <0,0001). (Setshwantsho 3a-c). Phokotsego ya tlhagiso ya mRNA e ne e ikaegile ka selekanyo: tlhagiso ya cMYC, NRF1 le TFAM e ne ya fokotsega ka makgetlo a le 5.7, 2.6 le 1.9 kwa 3 mM, ka go latelana, le ka makgetlo a le 11.2, 3 le 2.2 kwa 5 mM. Ho fapana le hoo, lefutso la biogenesis la redox le bohareng la NFE2L2 le ne le sa fetolwe ka bongata bofe kapa bofe ba PPA, le ha ho ile ha lemohuwa tlwaelo e tshwanang e itshetlehileng ka tekanyetso ya ho fokotseha ha polelo (Setshwantsho 3d).
Gape re ne ra sekaseka go tlhagisiwa ga dijini tsa bogologolo tse di amegang mo taolong ya go kgaogana le go kopana. STOML2 e akanngwa gore e amega mo go kopanyeng, mitophagy le biogenesis, mme tlhagiso ya yona e ne ya fokodiwa thata (p <0.0001) ka 3 mM (phetogo ya makgetlo a le 2.4) le 5 mM (phetogo ya makgetlo a le 2.8) PPA (Setshwantsho 1). 3d). Fela jalo, tlhagiso ya dijini tsa fusion tsa OPA1 e ne ya fokodiwa ka 3 mM (phetogo ya makgetlo a le 1.6) le 5 mM (phetogo ya makgetlo a le 1.9) PPA (p = 0.006 le p = 0.0024, ka go latelana) (Setshwantsho 3f). Le fa go ntse jalo, ga re a ka ra fitlhela dipharologano tse di botlhokwa mo go tlhagiseng dijini tsa fusion MFN1, MFN2 kgotsa dijini tsa fission DRP1 ka fa tlase ga kgatelelo ya 24-h PPA (Setshwantsho 3g-i). Mo godimo ga moo, re ne ra fitlhela gore maemo a diporoteine ​​tse nne tsa go kopana le tsa go kgaogana (OPA1, MFN1, MFN2 le DRP1) ga a ka a fetoga mo maemong a a tshwanang (Setshwantsho 4a–d). Go botlhokwa go ela tlhoko gore tshedimosetso eno e bontsha ntlha e le nngwe mo nakong mme e ka nna ya se ka ya bontsha diphetogo mo tlhagisong ya poroteine ​​kgotsa maemo a tiro ka nako ya dikgato tsa ntlha tsa kgatelelo ya PPA. Le fa go ntse jalo, diphokotso tse dikgolo tsa go tlhagisiwa ga cMYC, NRF1, TFAM, STOML2, le OPA1 di bontsha go sa laolegeng ga go kwalololwa ga di-mitochondria, go tlhamiwa ga ditshedi le go fetoga ga ditshedi. Ho phaella moo, dintlha tsena totobatsa tshebediso ya mekgwa ya ho nka ditshwantsho ho ithuta ka kotloloho diphetoho tsa boemo ba qetellong tshebetsong ya mitochondrial.
Dilekanyo tsa poroteine ​​tsa ntlha ya go kopana le go kgaoga ga di a fetoga morago ga kalafi ya esiti ya propionic (PPA). Disele tsa SH-SY5Y di ne tsa alafiwa ka 3 le 5 mM PPA ka 24 h. Maemo a protheine a ne a lekanngwa ka tshekatsheko ya Western blot, mme maemo a polelo a ne a tlwaelegile go ya go poroteine ​​yotlhe. Palogare ya poroteine ​​polelo le moemedi Bophirima blots ya sepheo le palo yohle poroteine ​​di bontshitswe. a - OPA1, b - MFN1, c - MFN2, d - DRP1. Dibara di emela palogare ± SEM, mme tshedimosetso e e bontshitsweng e emela dipoeletso tsa n = 3 tsa ditshedi. Dipapiso tse ngata (p <0.05) di ile tsa etswa ho sebediswa tlhahlobo ya tsela e le nngwe ya phapang le teko ya Dunnett. Gele ya ntlha le blot di bontshiwa mo Setshwantshong S1.
Go sa dire sentle ga mitochondrial go amana le malwetse a dithulaganyo tse dintsi go simolola ka malwetse a metaboliki, a pelo le a mesifa go ya kwa malwetseng a methapo1,10. Malwetse a mantsi a a senyang methapo le a a senyang methapo a amana le go sa dire sentle ga di- mitochondrial, mme seno se bontsha botlhokwa jwa di- organelles tseno mo nakong yotlhe ya botshelo jwa boboko. Malwetse ano a akaretsa bolwetse jwa Parkinson, bolwetse jwa Alzheimer le ASD3,4,18. Le fa go ntse jalo, go fitlhelela dithishu tsa boboko go ithuta malwetse ano go thata, segolobogolo mo maemong a metšhini, go dira gore dithulaganyo tsa sekao sa disele e nne tsela e nngwe e e tlhokegang. Mo thutong eno, re dirisa thulaganyo ya sekao sa disele re dirisa disele tsa SH-SY5Y tse di alafilweng ka PPA go boeletsa go sa dire sentle ga mitochondrial go go lemogilweng mo malwetseng a disele tsa boboko, segolobogolo mathata a autism spectrum. Go dirisa sekai seno sa PPA go ithuta diphetogo tsa mitochondrial mo di-neuron go ka nna ga dira gore re bone gore ASD e bakilwe ke eng.
Re ne ra sekaseka kgonagalo ya go dirisa TEM go leba diphetogo mo sebopegong sa di-mitochondria. Go botlhokwa go ela tlhoko gore TEM e tshwanetse go dirisiwa sentle go oketsa katlego ya yone. Go baakanyetsa di-cryo-specimens go dira gore go kgonege go boloka dibopego tsa di-neuron botoka ka go baakanya dikarolo tsa disele ka nako e le nngwe le go fokotsa go bopega ga dilo tse di dirilweng ka diatla34. Go dumalana le seno, re ne ra lemoga gore disele tsa SH-SY5Y tse di tshwanang le di-neuron di ne di na le di-organelles tse di sa senyega tsa disele tse dinnye le di-mitochondria tse di telele (Setshwantsho 1a). Sena se totobatsa tshebediso ya mekgwa ya ho lokisetsa cryogenic bakeng sa ho ithuta sebopeho sa mitochondrial dimotlolong tsa disele tsa di-neuron. Le fa ditekanyo tsa bontsi di le botlhokwa mo tshekatshekong e e nang le maikaelelo ya tshedimosetso ya TEM, ga go ise go nne le tumalano ya gore ke dipharametara dife tse di rileng tse di tshwanetseng go lekanngwa go netefatsa diphetogo tsa popego ya mitochondrial. E thehiloeng palo e kholo ea lithuto tse 'nileng tsa hlahloba ka bongata sebopeho sa mitochondrial17,31,32, re ile ra hlahisa peipi ea tshekatsheko ya setshwantsho sa mitochondrial e iketsang e lekanyang diparamente tse robedi tsa sebopeho, e leng: sebaka, sebaka2, tekanyo ya karolo, moedi, sedikadikwe, tekanyo , Feret bophara. le go nna sediko.
Gareng ga tsona, PPA e fokoditse thata lefelo la 2, lefelo, molelwane, le bophara jwa Feret (Setshwantsho 1b–e). Seno se bontshitse gore mitochondria e ne ya nna nnye le go nna kgolokwe, e leng se se tsamaelanang le dithutopatlisiso tse di fetileng tse di bontshang phokotsego ya lefelo la mitochondria morago ga diura di le 72 tsa kgatelelo ya mitochondria e e bakiwang ke PPA30. Dikarolo tseno tsa popego di ka supa go kgaogana ga di-mitochondrial, e leng thulaganyo e e tlhokegang ya go kgaoganya dikarolo tse di senyegileng mo mafaratlhatlheng a di-mitochondrial go rotloetsa go senyega ga tsone ka mitophagy35,36,37. Ka fa letlhakoreng le lengwe, go fokotsega ga bogolo jo bo magareng jwa mitochondria go ka amana le go oketsega ga biogenesis, e e felelang ka go bopega ga di-mitochondria tse dinnye tse di sa ntseng di tlhoga. Go oketsega ga go kgaogana kgotsa go tlhamiwa ga ditshedi go emela karabo ya pusetso go tshegetsa mitosis kgatlhanong le kgatelelo ya mitochondrial. Le fa go ntse jalo, go fokotsega ga kgolo ya mitochondria, go sa kopane sentle ga di-mitochondria kgotsa maemo a mangwe ga a ka ke a kgaphelwa thoko.
Le fa ditshwantsho tse di nang le resolushene e e kwa godimo tse di dirilweng ke TEM di dira gore go kgonege go tlhomamisa dipharologantsho tsa popego mo maemong a di-mitochondria ka bongwe, mokgwa ono o ntsha ditshwantsho tsa dikarolo tse pedi ka nako e le nngwe. Go ithuta dikarabo tse di fetogang tsa kgatelelo ya metaboliki, re ne ra tshasa mitochondria ka TMRE mme ra dirisa maekerosekopo ya nako e e fedileng ka tshekatsheko ya MEL, e e letlang pono ya 3D e e kwa godimo ya diphetogo mo mafaratlhatlheng a mitochondrial ka nako33,38. Re lemogile diphetogo tse di sa bonaleng mme di le botlhokwa mo diphetogong tsa mitochondrial ka fa tlase ga kgatelelo ya PPA (Setshwantsho 2). Ka 3 mM, palo ya ditiragalo tsa fission e ne ya oketsega thata, fa ditiragalo tsa fusion di ne di ntse di tshwana le mo taolong. Koketsego ya palo ya ditiragalo tsa bobedi tsa go kgaoga le go kopana e ne ya lemogwa kwa 5 mM PPA, fela diphetogo tseno di ne di ka nna tsa lekana, se se akantshang gore di-kinetics tsa go kgaogana le tsa go kopana di fitlhelela tekatekano kwa ditlhokegong tse di kwa godimo (Setshwantsho 2b). Palogare ya bolumu ya mitochondrial e ne ya nna e sa fetoge mo PPA ya 3 le 5 mM, e leng se se supang gore bothokgami jwa mafaratlhatlha a mitochondrial bo ne jwa bolokwa (Setshwantsho 2d). Seno se bontsha bokgoni jwa dineteweke tse di fetogang tsa mitochondrial go tsibogela kgatelelo e e botlhofo ya metaboliki go boloka homeostasis ka katlego kwantle ga go baka go kgaogana ga mafaratlhatlha. Ka 3 mM PPA, koketsego ya fission e lekane go rotloetsa phetogo go ya kwa tekatekanong e ntšhwa, fela go tlhokega go bopa sešwa go go tseneletseng ga kinetic go tsibogela kgatelelo e e tlhotlhelediwang ke dilekanyo tse di kwa godimo tsa PPA.
Palo ya mitochondria e ne ya oketsega mo ditlhotlheletsong tsa kgatelelo ya PPA ka bobedi, mme palogare ya bolumu ya mitochondria ga e a fetoga thata (Setshwantsho 2c). Seno se ka tswa se bakilwe ke go oketsega ga biogenesis kgotsa go oketsega ga karogano; le fa go ntse jalo, fa go se na phokotsego e e bonalang ya bolumu e e magareng ya mitochondrial, go ka direga thata gore biosynthesis e oketsege. Le fa go ntse jalo, tshedimosetso e e mo Setshwantshong sa 2 e tshegetsa go nna teng ga mekgwa e mebedi ya go duelela: koketsego ya palo ya ditiragalo tsa go kgaogana, e e tsamaelanang le go laolwa ga go kgaogana ga mitochondrial, le koketsego ya palo ya ditiragalo, e e tsamaelanang le biogenesis ya mitochondrial. Kwa bofelong, pusetso e e maatla ya kgatelelo e e botlhofo e ka nna le dithulaganyo tsa ka nako e le nngwe tse di akaretsang go kgaogana, go kopana, biogenesis le mitophagy. Le fa bakwadi ba ba fetileng ba bontshitse gore PPA e tokafatsa mitosis30,39 le mitophagy29, re tlamela ka bosupi jwa go bopa sešwa ga go kgaogana ga mitochondrial le diphetogo tsa go kopana go tsibogela PPA. Dintlha tsena di netefatsa diphetoho tsa sebopeho tse lemohilweng ke TEM mme di fana ka kutlwisiso e eketsehileng ka mekgwa e amanang le ho se sebetse ha mitochondrial ho hlohlelleditsweng ke PPA.
Ka gonne tshekatsheko ya TEM kgotsa ya MEL e ne e sa neye bosupi jo bo tlhamaletseng jwa mekgwa ya go laola dijini e e neng e le ka fa tlase ga diphetogo tse di lemogilweng tsa popego, re ne ra sekaseka go tlhagisiwa ga RNA ga dijini tse di amegang mo go fetoleng dijo tsa mitochondrial, biogenesis le go fetoga ga dijini. Proto-oncogene ya cMYC ke ntlha ya go kwalolola e e amegang mo taolong ya di-mitochondria, glycolysis, diaminoesiti le diesiti tsa mafura40. Mo godimo ga moo, cMYC e itsege ka go laola go tlhagisiwa ga dijini di ka nna 600 tsa mitochondrial tse di amegang mo go kwalololeng ga mitochondria, go ranola le go kopanya dilo tse di raraaneng, go akaretsa le NRF1 le TFAM41. NRF1 le TFAM ke balaodi ba babedi ba bogare ba mitosis, ba ba dirang kwa tlase ga PGC-1α go dira gore mtDNA e ipoeletsa. Tsela ena e sebediswa ke cAMP le AMPK matshwao mme e bosisi ho tshebediso ya eneji le kgatello ya metaboliki. Re ne gape ra sekaseka NFE2L2, e leng molaodi wa redox wa biogenesis ya mitochondrial, go bona gore a ditlamorago tsa PPA di ka tswa di tseregangwa ke kgatelelo ya oksijene.
Le fa polelo ya NFE2L2 e ne ya nna e sa fetoge, re ne ra fitlhela phokotsego e e tlhomameng e e ikaegileng ka selekanyo sa melemo mo polelong ya cMYC, NRF1 le TFAM morago ga 24 h ya kalafi ka 3 mM le 5 mM PPA (Setshwantsho 3a-c). Go fokotsa tlhagiso ya cMYC go begilwe mo nakong e e fetileng jaaka karabo ya kgatelelo ya mitochondrial42, mme ka fa letlhakoreng le lengwe, go fokotsa tlhagiso ya cMYC go ka baka go sa dire sentle ga mitochondrial ka go fetola metabolism ya mitochondrial, kgolagano ya mafaratlhatlha, le go kgaogana ga lera43. Se se kgatlhang ke gore, cMYC gape e amega mo taolong ya go kgaogana ga di-mitochondria le go kopana ga tsone42,43 mme e itsege ka go oketsa phosphorylation ya DRP1 le go nna ga di-mitochondria mo lefelong le le rileng ka nako ya go kgaogana ga disele44, mmogo le go tsereganya go bopiwa sešwa ga popego ya di-mitochondria mo diseleng tsa motheo tsa di-neuron45. Eleruri, di-fibroblast tse di tlhaelang cMYC di bontsha bogolo jo bo fokoditsweng jwa mitochondrial, jo bo tsamaelanang le diphetogo tse di bakiwang ke kgatelelo ya PPA43. Dintlha tseno di bontsha kamano e e kgatlhang mme e sa ntse e sa tlhaloganyesege fa gare ga cMYC le diphetogo tsa mitochondrial, e e tlamelang ka setlhogo se se kgatlhang sa dithuto tsa isagwe tsa go tlhabololwa sešwa go go bakiwang ke kgatelelo ya maikutlo ya PPA.
Phokotso ya NRF1 le TFAM e tsamaisana le seabe sa cMYC jaaka sedirisiwa se se botlhokwa sa go kwalolola. Dintlha tseno gape di tsamaisana le dithuto tse di fetileng mo diseleng tsa kankere ya mala a magolo tsa batho tse di bontshang gore PPA e fokoditse go tlhagisiwa ga NRF1 mRNA ka diura di le 22, e e neng e amana le go fokotsega ga ATP le go oketsa ROS46. Bakwadi bano gape ba ne ba bega gore go tlhagelela ga TFAM go ne ga oketsega ka diura di le 8.5 mme ga boela kwa maemong a motheo ka diura di le 22. Go farologana le seo, Kim et al. (2019) e bontshitse gore polelo ya TFAM mRNA e ne ya fokotsega thata morago ga 4 h ya kgatelelo ya PPA mo diseleng tsa SH-SY5Y; le fa go ntse jalo, morago ga diura di le 72, go tlhagisiwa ga poroteine ​​ya TFAM go ne ga okediwa thata mme palo ya dikhopi tsa mtDNA e ne ya okediwa thata. Ka jalo, go fokotsega ga palo ya dijini tsa biogenesis tsa mitochondrial tse re di lemogileng morago ga diura di le 24 ga go kgaphe kwa thoko kgonagalo ya gore go oketsega ga palo ya mitochondria go amana le go dira ga biogenesis mo dintlheng tsa nako tsa pelenyana. Dithuto tse di fetileng di bontshitse gore PPA e laola thata mRNA ya PGC-1α le poroteine ​​mo diseleng tsa SH-SY5Y ka diura di le 4 le metsotso e le 30, fa esiti ya propionic e tokafatsa biogenesis ya mitochondrial mo di-hepatocyte tsa namane ka PGC-1α ka diura di le 12 le metsotso e le 39. Se se kgatlhang ke gore, PGC-1α ga se fela molaodi yo o tlhamaletseng wa go kwalolola ga NRF1 le TFAM, mme gape go bontshitswe gore e laola tiro ya MFN2 le DRP1 ka go laola fission le fusion47. Fa di tsewa mmogo, seno se tlhagisa go kopana go go gaufi ga mekgwa e e laolang dikarabo tsa pusetso tsa mitochondrial tse di tlhotlhelediwang ke PPA. Ho feta moo, ya data rona bontša dysregulation bohlokoa ya taolo ya phetolelo ya biogenesis le metabolism tlas'a kgatello ya PPA.
Dijini tsa STOML2, OPA1, MFN1, MFN2 le DRP1 di gareng ga balaodi ba ba botlhokwa ba go kgaogana ga di-mitochondria, go kopana ga tsone le go fetoga ga tsone37,48,49. Ho na le dijini tse ding tse ngata tse amehang diphetohong tsa mitochondrial, leha ho le jwalo, STOML2, OPA1 le MFN2 di fumanwe pele hore di na le methylated e fapaneng dihlopheng tsa ASD,16 mme dithuto tse mmalwa tse ikemetseng di tlalehile diphetoho dintlheng tsena tsa ho ngolwa ho arabela kgatello ya mitochondrial50,5. 52. Polelo ya bobedi OPA1 le STOML2 e ne ya fokodiwa thata ke kalafi ya 3 mM le 5 mM PPA (Setshwantsho 3e, f). OPA1 ke nngwe ya balaodi ba tlwaelo ba go kopana ga di-mitochondrial ka tirisanommogo e e tlhamaletseng le MFN1 le 2 mme e na le seabe mo go bopeng sešwa ga di-cristae le mo popego ya di-mitochondrial53. Seabe se se tlhomameng sa STOML2 mo go fetogeng ga di-mitochondria ga se ise se tlhaloganyesege sentle, mme bosupi bo bontsha gore e na le seabe mo go kopanyeng ga di-mitochondria, mo go tlhameng ditshedi le mo go jeng di-mitochondria.
STOML2 e amega mo go bolokeng go kopana ga go hema ga mitochondrial le go bopa di-complex tsa ketane ya go hema54,55 mme go bontshitswe gore e fetola thata dipharologantsho tsa metaboliki tsa disele tsa kankere56. Dithutopatlisiso di bontshitse gore STOML2 e rotloetsa bokgoni jwa lera la mitochondrial le go tlhamiwa ga ditshedi ka tirisanommogo le BAN le cardiolipin 55, 57, 58. Mo godimo ga moo, dithutopatlisiso tse di ikemetseng di bontshitse gore tirisanommogo magareng ga STOML2 le PINK1 e laola mitophagy59,60. Go tlhokomelwa gore, STOML2 e begilwe gore e dirisana ka tlhamalalo le go tlhomamisa MFN2 mme gape e na le seabe se se botlhokwa mo go tlhomamiseng di-isoform tse ditelele tsa OPA1 ka go thibela protease e e ikarabelang mo go senyegeng ga OPA153,61,62. Phokotso ya polelo ya STOML2 e e lemogilweng mo ditsibogong tsa PPA e ka dira gore diporoteine ​​tseno tsa fusion di nne bonolo go senyega ka ditsela tse di ikaegileng ka ubiquitin le proteasome48. Le fa seabe se se tlhomameng sa STOML2 le OPA1 mo tsibogong e e fetogang ya PPA se sa tlhaloganyesege, go fokotsega ga go tlhagisiwa ga dijini tseno tsa fusion (Setshwantsho 3) go ka kgoreletsa tekatekano magareng ga fission le fusion mme ga dira gore bogolo jwa mitochondrial bo fokotsege (Setshwantsho 3). 1).
Ka fa letlhakoreng le lengwe, tlhagiso ya poroteine ​​ya OPA1 e ne ya nna e sa fetoge morago ga 24 h, fa maemo a mRNA le a poroteine ​​a MFN1, MFN2 kgotsa DRP1 a ne a sa fetoge thata morago ga kalafi ya PPA (Setshwantsho 3g-i, Setshwantsho 4). Seno se ka tswa se bontsha gore ga go na diphetogo mo taolong ya dilo tseno tse di amegang mo go kopaneng le mo go kgaoganeng ga di-mitochondria. Le fa go ntse jalo, go botlhokwa go ela tlhoko gore nngwe le nngwe ya dijini tseno tse nnè gape e laolwa ke diphetogo tsa morago ga go kwalololwa ga dijini (PTM) tse di laolang tiro ya diporoteine. OPA1 e na le mefuta e mengwe e le robedi ya go kopanya e e kgaoganngwang ka diporoteine ​​mo maitokhondria go tlhagisa di-isoform tse pedi tse di farologaneng 63 . Tekatekano magareng ga di-isoform tse ditelele le tse dikhutshwane e feleletsa e laola seabe sa OPA1 mo go kopanyeng ga di-mitochondrial le mo go tlhokomeleng mafaratlhatlha a di-mitochondrial64. Tiro ya DRP1 e laolwa ke fosforoile ya poroteine ​​kinase II (CaMKII) e e ikaegileng ka khalesiamo/kalmodulini, fa go senyega ga DRP1 go laolwa ke go nna teng gongwe le gongwe le SUMOylation65. Kwa bofelong, DRP1 le MFN1/2 ka bobedi ke di-GTPase, ka jalo tiro e ka tlhotlhelediwa ke selekanyo sa go tlhagisiwa ga GTP mo di-mitochondria 66 . Ka jalo, le fa go tlhagisiwa ga diporoteine ​​tseno go sa fetoge, seno se ka nna sa se ka sa bontsha tiro ya diporoteine ​​e e sa fetogeng kgotsa go nna mo lefelong le le rileng67,68. Ee, di-repertoire tsa diporoteine ​​tsa PTM tse di leng teng gantsi di dira jaaka mola wa ntlha wa tshireletso o o ikarabelang ka go tsereganya dikarabo tsa kgatelelo e e botlhoko. Fa go na le kgatelelo e e magareng ya metaboliki mo sekaong sa rona, go ka direga gore PTM e rotloetse tiro e e oketsegileng ya diporoteine ​​tsa fusion le fission go busetsa bothokgami jwa mitochondrial ka mo go lekaneng kwantle ga go tlhoka go tsenngwa tirisong go go oketsegileng ga dijini tseno mo maemong a mRNA kgotsa a poroteine.
Fa di tsewa mmogo, tshedimosetso e e fa godimo e tlhagisa taolo e e raraaneng le e e ikaegileng ka nako ya popego ya mitochondrial le dikgwetlho tsa go tlhalosa mekgwa eno. Go ithuta go tlhagisiwa ga dijini, go botlhokwa pele go supa dijini tse di rileng tse di ikaeletsweng mo tseleng. Le fa go ntse jalo, tshedimosetso ya rona e bontsha gore dijini tse di mo tseleng e le nngwe ga di tsibogele kgatelelo e e tshwanang ka tsela e e tshwanang. Tota e bile, dithuto tse di fetileng di bontshitse gore dijini tse di farologaneng mo tseleng e le nngwe di ka nna tsa bontsha diporofaele tse di farologaneng tsa karabo ya nakwana30,46. Mo godimo ga moo, go na le mekgwa e e raraaneng ya morago ga go kwalololwa ga dijini e e kgoreletsang kamano fa gare ga go kwalololwa ga dijini le go dira ga dijini. Dithuto tsa proteomic di ka fana ka kutlwisiso ya tshusumetso ya di-PTM le tshebetso ya diprotheine, empa hape di tlisa dikgwetlho tse kenyeletsang mekgwa e tlase ya tshebediso, ditekanyetso tse phahameng tsa letshwao-ho-modumo, le tharollo e mpe.
Mo bokaong jono, go ithuta popego ya mitochondrial go dirisiwa TEM le MEL go na le bokgoni jo bogolo jwa go rarabolola dipotso tsa motheo ka kamano fa gare ga diphetogo tsa mitochondrial le tiro ya tsone le kafa seno se tlhotlheletsang bolwetse ka gone. Sa botlhokwa le go feta, TEM e naya mokgwa o o tlhamaletseng wa go lekanya popego ya mitochondrial jaaka ntlha ya bokhutlo e e kopaneng ya go sa dire sentle ga mitochondrial le diphetogo tsa yone51. MEL gape e naya mokgwa o o tlhamaletseng wa go bona ka leitlho la mogopolo ditiragalo tsa go kgaogana le go kopana mo tikologong ya disele tsa tlhakoretharo, e leng se se letlang go lekanyetsa go tlhabololwa ga disele tse di fetofetogang le fa go se na diphetogo mo go tlhagiseng dijini33. Mona re totobatsa tshebediso ya mekgwa ya ho nka ditshwantsho tsa mitochondrial mafu a bobedi a mitochondrial. Malwetse ano ka tlwaelo a tlhaolwa ke kgatelelo e e sa foleng e e bonolo ya metaboliki e e tlhaolwang ke go bopiwa sešwa ka tsela e e bofitlha ga dineteweke tsa mitochondrial go na le tshenyo e e bogale ya mitochondrial. Le fa go ntse jalo, pusetso ya mitochondrial e e tlhokegang go boloka mitosis ka fa tlase ga kgatelelo e e sa foleng e na le ditlamorago tse di tseneletseng tsa tiro. Mo bokaong jwa saense ya methapo, go tlhaloganya botoka mekgwa eno ya go duelela go ka nna ga tlamela ka tshedimosetso e e botlhokwa ka ga bolwetse jwa methapo jwa pleiotropic jo bo amanang le go sa dire sentle ga mitochondrial.
Kwa bofelong, tshedimosetso ya rona e tlhagisa tiriso ya mekgwa ya go tsaya ditshwantsho ya go tlhaloganya ditlamorago tse di dirang tsa ditirisano tse di raraaneng fa gare ga go tlhagisiwa ga dijini, diphetogo tsa diporoteine ​​le tiro ya diporoteine ​​tse di laolang diphetogo tsa di-neuron mitochondrial. Re dirisitse PPA go dira sekao sa go sa dire sentle ga mitochondrial mo sekaong sa sele ya disele tsa boboko go bona temogo go karolo ya mitochondrial ya ASD. Disele tsa SH-SY5Y tse di alafilweng ka PPA di bontshitse diphetogo mo sebopegong sa di-mitochondria: di-mitochondria di ne tsa nna dinnye le go nna kgolokwe, mme di-cristae di ne di sa tlhalosiwe sentle fa di lemogiwa ka TEM. Tshekatsheko ya MEL e bontsha gore diphetogo tseno di diragala ka nako e le nngwe le koketsego ya ditiragalo tsa fission le fusion go tshegetsa mafaratlhatlha a mitochondrial go tsibogela kgatelelo e e botlhofo ya metaboliki. Ho feta moo, PPA e sitisa haholo taolo ya phetolelo ya phetoho ya dijo tsa mitochondrial le homeostasis. Re supile cMYC, NRF1, TFAM, STOML2, le OPA1 e le balaodi ba konokono ba mitochondrial ba ba kgorelediwang ke kgatelelo ya PPA mme ba ka nna ba nna le seabe mo go tsereganyeng mo diphetogong tse di tlhotlhelediwang ke PPA mo sebopegong le mo tirong ya mitochondrial. Dithuto tsa isago di a tlhokega go tlhaola botoka diphetogo tsa nakwana tse di tlhotlhelediwang ke PPA mo go tlhagiseng dijini le tiro ya diporoteine, go dira gore di nne tsa selegae, le diphetogo tsa morago ga go ranola. Dintlha tsa rona di totobatsa ho rarahana le ho itshetleha ha mekgwa ya taolo e buisang karabelo ya kgatello ya mitochondrial le ho bontsha tshebediso ya TEM le mekgwa e meng ya ho nka ditshwantsho bakeng sa dithuto tse ngata tse lebisitsweng tsa mekgwa.
Mola wa disele tsa SH-SY5Y (ECACC, 94030304-1VL) o ne wa rekwa go tswa go Sigma-Aldrich. Disele tsa SH-SY5Y di ne tsa jalwa mo motswakong wa dikotla wa Dulbecco o o fetotsweng wa Eagle (DMEM/F-12) le L-glutamine (SC09411, ScienCell) mo difolasekeng tsa 25 cm2 tse di tlaleleditsweng ka 20% ya serum ya kgomo ya lesea le le mo popelong (FBS91) le 1% ya phenisilini-setereptomaesini (P4333-20ML, Sigma-Aldrich) ka 37 °C, 5% ya CO2. Disele di ne tsa tlholwa go fitlha go 80% ya go kopana ka go dirisa 0.05% ya trypsin-EDTA (15400054), tsa tlhotlhiwa ka 300 g mme tsa tsenngwa ka kitlano ya disele di ka nna 7 × 105/ml. Diteko tsotlhe di ne tsa dirwa mo diseleng tsa SH-SY5Y tse di sa farologanngwang fa gare ga ditemana 19–22. PPA e tsamaiswa e le NaP. Phatlalatsa phofo ya NaP (CAS No. 137-40-6, fomula ya khemikhale C3H5NaO2, P5436-100G, Sigma-Aldrich) metsing a futhumetseng a MilliQ ho fihlela ho bongata ba 1 M mme o boloke ka 4 °C. Ka letsatsi la kalafo, tlhatswa tharabololo eno ka 1 M PPA go ya go 3 mM le 5 mM PPA mo sedirisiweng se se senang serum (DMEM/F-12 e e nang le L-glutamine). Ditlhokego tsa kalafi tsa ditekelelo tsotlhe e ne e se PPA (0 mM, taolo), 3 mM, le 5 mM PPA. Diteko di ne tsa dirwa mo dipoeletsong tse di ka nnang tharo tsa ditshedi.
Disele tsa SH-SY5Y di ne tsa jalwa mo difolasekeng tsa 25 cm5 ka seelo sa disele tsa 5.5 × 105/ml mme tsa godisiwa diura di le 24. Kalafo ya PPA e ne ya tsenngwa mo folasekeng pele ga 24 h ya go tlhoga. Kgobokanya dipelete tsa disele go latela diporothokholo tse di tlwaelegileng tsa subculture ya dithishu tsa diamusi (tse di tlhalositsweng fa godimo). Emisa gape pelete ya sele mo 100 μl ya 2.5% ya glutaraldehyde, 1 × PBS mme o e boloke ka 4 °C go fitlha e dirisiwa. Disele tsa SH-SY5Y di ne tsa tlhotlhorega ka bokhutshwane go dira disele le go tlosa 2.5% ya glutaraldehyde, tharabololo ya 1 × PBS. Resuspend sediment mo 4% ya agarose gel e e baakantsweng mo metsing a a tlhotlhilweng (tekanyetso ya agarose go bolumu ya sediment ke 1:1). Dikarolwana tsa Agarose di ne di bewa mo di-grid mo dipoleiteng tse di sephaphathi mme tsa apesiwa ka 1-hexadecene pele ga go gatsela ga kgatelelo e e kwa godimo. Disampole di ne tsa gatsediwa mo 100% ya acetone e e omileng kwa -90°C diura di le 24. Morago ga moo themphereitšha e ne ya tlhatlosiwa go ya go -80°C mme tharabololo ya 1% ya osmium tetroxide le 0.1% ya glutaraldehyde e ne ya okediwa. Disampole di ne di bolokwa ka -80°C diura di le 24. Morago ga se, themphereitšha e ne ya okediwa ka iketlo go ya kwa themphereitšheng ya phaposi mo malatsing a le mmalwa: go tswa go – 80 °C go ya go – 50 °C mo diureng di le 24, go ya go – 30 °C mo diureng di le 24, go ya go – 10 °C mo diureng di le 24 mme kwa bofelong go ya kwa themphereitšheng ya phaposi. themperetšha.
Morago ga paakanyo ya cryogenic, disampole di ne tsa tsenngwa ka resin mme dikarolo tse di sesane thata (∼100 nm) di ne tsa dirwa go dirisiwa sedirisiwa sa Leica Reichert UltracutS (Leica Microsystems). Dikarolo di ne di tshasitswe ka 2% ya uranyl asetate le citrate ya lloto. Disampole di ne tsa lemogwa ka go dirisa maekerosekopo ya eleketeroniki ya phetiso ya FEI Tecnai 20 (ThermoFisher (e e kileng ya bo e le FEI), Eindhoven, Netherlands) e e dirang ka 200 kV (sefetisi sa Lab6) le khamera ya Gatan CCD (Gatan, UK) e e nang le setlhotlhi sa maatla sa Tridiem.
Mo poeletso nngwe le nngwe ya setegeniki, go ne ga bonwa bobotlana ditshwantsho di le 24 tsa sele e le nngwe, e leng palogotlhe ya ditshwantsho di le 266. Ditshwantsho tsotlhe di ne tsa sekasekwa go dirisiwa makro wa Kgaolo ya Kgatlhego (ROI) le makro wa Mitochondria. Makro wa mitochondrial o theilwe mo mekgweng e e gatisitsweng17,31,32 mme o letla go dira ditshwantsho tsa TEM ka setlhopha se se itirisang kwa Fiji/ImageJ69. Ka bokhutshwane: setshwantsho se fetotswe le go fetolwa ka go dirisa go ntsha lemorago la bolo e e bidikamang (radius ya dipiksele di le 60) le setlhotlhi sa bandpass sa FFT (go dirisa melelwane e e kwa godimo le e e kwa tlase ya dipiksele di le 60 le 8 ka go latelana) le go gatelelwa ga mola o o emeng ka kgotlelelo ya tlwaelo ya 5%. The sebetswa setshwantsho e ka tsela e iketsang thresholded sebelisa palo e kahodimodimo entropy dikgatotharabololong le maske binary e hlahiswa. Dikgaolo tsa ditshwantsho tse di amanang le di-ROI tse di tlhophilweng ka diatla mo ditshwantshong tse di tala tsa TEM di ne tsa ntshiwa, di tlhaola mitochondria mme di sa akaretse lera la polasema le dikgaolo tse dingwe tse di nang le pharologano e e kwa godimo. Bakeng sa ROI e nngwe le e nngwe e ntshitsweng, dikarolwana tse pedi tse kgolo ho feta dipikselse tse 600 di ile tsa sekasekwa, mme sebaka sa dikarolwana, moedi, dilepe tse kgolo le tse nyane, bophara ba Feret, bophahamo, le sediko di ile tsa lekanngwa ho sebediswa mesebetsi ya ho lekanya e hahilweng ya Fiji / ImageJ. Ho latela Merrill, Flippo, le Strack (2017), sebaka sa 2, tekanyetso ya karolo ya dikarolwana (tekanyetso ya aseke e kgolo ho ya ho e nyane), le ntlha ya sebopeho (FF) di ile tsa balwa ho tswa dintlheng tsena, moo FF = molelwane wa 2/4pi x sebaka. Tlhaloso ya fomula ya dipharametara e ka bonwa mo go Merrill, Flippo, le Strack (2017). Dimakro tse di umakilweng di teng mo GitHub (bona Polelo ya go nna teng ga Tshedimosetso). Ka palogare, dikarolwana di ka nna 5,600 di ne tsa sekasekwa ka kalafi ya PPA, go bona palogotlhe ya dikarolwana di ka nna 17,000 (tshedimosetso ga e a bontshiwa).
Disele tsa SH-SH5Y di ne tsa bewa mo dijaneng tsa setso tsa diphaposi di le 8 (ThermoFisher, #155411) go letla kgomarelo bosigo jotlhe mme morago ga moo tsa tlhokomelwa ka TMRE 1:1000 (ThermoFisher, #T669) le Hoechst 33342 1:200 HgmaA200. go fetola mmala. Ditshwantsho di ne tsa bonwa ka go dirisa dileisara tsa 405 nm le 561 nm mo tikologong ya metsotso e le 10, mme ditshwantsho tse di tala di ne tsa bonwa e le ditlhopha tsa z tse di nang le dimaekerokerafo tsa ditshwantsho di le 10 tse di nang le kgato ya az ya 0.2 μm fa gare ga diforeime tsa ditshwantsho ka nako e le 12 e e latelang . Ditshwantsho di ne tsa kokoanngwa go dirisiwa polatefomo ya Carl Zeiss LSM780 ELYRA PS.1 ya resolushene e e kwa godimo (Carl Zeiss, Oberkochen, Jeremane) go dirisiwa lense ya LCI Plan Apochromate 100x/1.4 Oil DIC M27. Ditshwantsho di ne tsa sekasekwa mo ImageJ go dirisiwa peipi e e tlhalositsweng pelenyana le plugin ya ImageJ go lekanya ditiragalo tsa go kopana le go kgaogana, palogare ya dibopego tsa mitochondrial, le palogare ya bolumu ya mitochondrial ka sele33. Dimakro tsa MEL di teng mo GitHub (bona Polelo ya go nna teng ga Tshedimosetso).
Disele tsa SH-SY5Y di ne di jadisitswe mo dipoleiting tsa didiba di le thataro ka kitlano ya disele tsa 0.3 × 106/mL diura di le 24 pele ga kalafi. RNA e ne ya ntshiwa ka go dirisa porothokholo ya Quick-RNA TM Miniprep (ZR R1055, Zymo Research) ka diphetogo tse dinnye: tsenya 300 μl ya sethibela-go tlhotlhora sa RNA mo sedibeng sengwe le sengwe pele ga go tlosiwa mme o tlhotlhore sampole nngwe le nngwe jaaka kgato ya bofelo ka 30 μl ya go tlhotlhora ga DNase/RNase. -metsi a mahala. Disampole tsotlhe di ne tsa tlholwa go bona bontsi le boleng go dirisiwa Sepekterofotometara sa UV-Vis sa NanoDrop ND-1000. Palogotlhe ya poroteine ​​go tswa mo di-lysates tsa disele e ne ya bonwa ka go dirisa 200 μl ya RIPA lysis buffer, mme selekanyo sa poroteine ​​se ne sa lekanngwa ka go dirisa tlhatlhobo ya poroteine ​​ya Bradford70.
Tshwaraganyo ya cDNA e ne ya dirwa ka go dirisa Sediriswa sa Tshwaraganyo sa cDNA sa TetroTM (BIO-65043, Meridian Bioscience) go ya ka ditaelo tsa motlhagisi ka diphetogo dingwe. cDNA e ne ya tlhakanngwa mo diphetogong tsa 20-μl go dirisiwa 0.7 go ya go 1 μg ya RNA yotlhe. Di-primer di ne tsa tlhophiwa go tswa mo dipampiring tse di gatisitsweng pele tsa 42, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 (Lenaneo la S1) mme di-probe tse di tsamayang le tsone di ne tsa tlhamiwa go dirisiwa sedirisiwa sa PrimerQuest go tswa kwa Dithekenolojing tsa DNA tse di Kopantsweng. Dijini tsotlhe tse di kgatlhang di ne tsa tlwaelesega go nna jini ya B2M ya nyutlea. Polelo ya dijini tsa STOML2, NRF1, NFE2L2, TFAM, cMYC le OPA1 e ne ya lekanngwa ka RT-qPCR. Motswako o mogolo o ne o akaretsa polymerase ya LUNA Taq (M3003L, Biolabs ya New England), di-primer tsa 10 μM tsa kwa pele le tsa kwa morago, cDNA, le metsi a maemo a PCR go ntsha bolumu ya bofelo ya 10 μL ya tsibogo nngwe le nngwe. Polelo ya dijini tsa karohano le tsa ho arohana (DRP1, MFN1 / 2) e ne e lekanngwa ho sebediswa diteko tsa TaqMan tse ngata. Motswako wa Mong wa qPCR wa Bokahohleng ba Luna (M3004S, New England Biolabs) o ne o sebediswa ho latela ditaelo tsa moetsi ka diphetolo tse nyane. Motswako wa RT-qPCR o o nang le dikarolo tse dintsi o akaretsa polymerase ya 1X LUNA Taq, di-primer tsa 10 μM tsa kwa pele le tsa kwa morago, di-probe tsa 10 μM, cDNA, le metsi a maemo a PCR, mme seno se felela ka bolumu ya bofelo ya 20 μL ya tsibogo nngwe le nngwe. RT-qPCR e ne ya dirwa ka go dirisa Rotor-Gene Q 6-plex (QIAGEN RG—nomoro ya tatelano: R0618110). Maemo a go tsamaya ka baesekele a bontshiwa mo Lenaneong S1. Disampole tsotlhe tsa cDNA di ne tsa godisiwa ka makgetlo a le mararo mme go ne ga tlhagisiwa sebopego se se tlwaelegileng go dirisiwa motseletsele wa ditlhaoloso tse di menaganeng ga lesome. Di-outlier mo disampole tse di gatisitsweng gararo tse di nang le phapogo e e tlwaelegileng ya molelwane wa modikologo (Ct) >0.5 di ne tsa tlosiwa mo tshekatshekong go netefatsa gore tshedimosetso e ka tlhagisiwa gape30,72. Polelo e e amanang le dijini e ne ya balelwa ka go dirisa mokgwa wa 2-ΔΔCt79.
Disampole tsa poroteine ​​(60 μg) di ne di kopantswe le sethibela-mafura sa ho laisa sa Laemmli ka tekanyo ya 2:1 mme di tsamaiswa ka jele ya protheine e se nang mmala ya 12% (Bio-Rad #1610184). Diporoteine ​​di ne tsa fetisediwa kwa leraleng la PVDF (#170-84156, Bio-Rad) go dirisiwa thulaganyo ya Trans-Blot Turbo (#170-4155, Bio-Rad). Lera le ne la thibelwa mme la tlhokomelwa ka dilwantsha-ditwatsi tsa motheo tse di maleba (OPA1, MFN1, MFN2, le DRP1) (tse di tlhaolositsweng ka 1:1000) diura di le 48, mme tsa latelwa ke dilwantsha-ditwatsi tsa bobedi (1:10,000) ka ura e le 1. Dimembrane di ne tsa tsewa ditshwantsho ka go dirisa Sediriswa sa ECL sa Bophirima sa Clarity (#170-5061, Bio-Rad) mme tsa kwalwa ka go dirisa thulaganyo ya Bio-Rad ChemiDoc MP. ImageLab mofuta wa 6.1 e ne e sebediswa bakeng sa tshekatsheko ya Bophirima blot. Gele ya ntlha le blot di bontshiwa mo Setshwantshong S1. Tshedimosetso ya twantsho e neetswe mo Lenaneong S2.
Ditlhopha tsa tshedimosetso di tlhagisiwa jaaka palogare le phoso e e tlwaelegileng ya palogare (SEM) ya bonnye disampole tse tharo tse di ikemetseng. Ditlhopha tsa tshedimosetso di ne tsa lekwa go bona gore a di tlwaelegile go dirisiwa teko ya Shapiro-Wilks (ntle le fa go boletswe ka tsela e sele) pele ga go tsaya kabo ya Gaussian le diphapogo tse di lekanang tse di tlwaelegileng le go tswelela ka ditshekatsheko. Mo godimo ga go sekaseka sete ya tshedimosetso ka go dirisa MEL LSD ya ga Fisher (p <0.05), ANOVA ya tsela e le nngwe (kalafi kgatlhanong le palogare ya taolo), le teko ya papiso e ntsi ya ga Dunnett go bona botlhokwa (p <0.05). Dipalopalo tse di botlhokwa tsa p di bontshiwa mo kerafong jaaka *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. Ditshekatsheko tsotlhe tsa dipalopalo le dikerafo di ne tsa dirwa le go tlhagisiwa go dirisiwa GraphPad Prism 9.4.0.
Dimakro tsa Fiji/ImageJ tsa tshekatsheko ya ditshwantsho tsa TEM di teng phatlalatsa mo GitHub: https://github.com/caaja/TEMMitoMacro. Makro wa Sebatli sa Ditiragalo tsa Mitochondria (MEL) o ka bonwa phatlalatsa mo GitHub:
Meiliana A., Devi NM le Vijaya A. Di-mitochondria: balaodi ba bagolo ba go fetoga ga dijo, go nna mo mmeleng, go ngomoga pelo, go tsofala le go nna teng ga dijini. Seindonesia. Saense ya Kalafi ya Ditshedi. J. 13, 221-241 (2021).
Ben-Shachar, D. Go sa dire sentle ga di-mitochondria tse di nang le dikarolo tse dintsi mo bolwetseng jwa tlhaloganyo, jo bo raraaneng jwa I jaaka selo se se ka nnang teng sa bolwetse. Bolwetse jwa tlhaloganyo. motswedi. 187, 3-10 (2017).
Bose, A. le Beal, MF Go sa dire sentle ga di-mitochondria mo bolwetseng jwa Parkinson. J. Khemeseteri ya Methapo. 139, 216-231 (2016).
Sharma VK, Singh TG le Mehta V. Di-mitochondria tse di gateletsweng: dintlha tsa go tlhaselwa mo bolwetseng jwa Alzheimer. Dimaekhondria 59, 48-57 (2021).
Di-mitochondria le boboko: maatla a ditshedi le tse dingwe. Botlhole jwa methapo. motswedi. 36, 219-238 (2019).
Rangaraju, V. le ba bangwe. Di-mitochondria tsa Pleiotropic: tshusumetso ya di-mitochondria mo kgolong ya disele tsa boboko le bolwetse. J. Saense ya Methapo. 39, 8200-8208 (2019).
Cardaño-Ramos, C. le Morais, VA Go tlhamiwa ga di-mitochondria mo di-neuron: jang le kae. boditšhabatšhaba. J. Mohr saense. 22, 13059 (2021).
Yu, R., Lendahl, U., Nister, M. le Zhao, J. Taolo ya diphetogo tsa di-mitochondrial tsa diamusi: ditshono le dikgwetlho. pele. endokraine. 11, 374 (2020).
Khacho, M. le Slack, RS Diphetogo tsa di-mitochondria mo taolong ya go tlhamiwa ga methapo: go tswa mo bobokong jo bo golang go ya kwa bobokong jo bo godileng. tlhabololo. e e fetofetogang. 247, 47-53 (2018).