Go tlhaola diporoteine ​​mo tseleng ya go ntsha diporoteine ​​go botlhokwa go boloka go kgaoganngwa ga disele le go nna mo maemong a a siameng. Mo godimo ga go tlhaola ka dikgapetla, seabe sa dilipidi mo go tlhaoleng ga kinesin mo thulaganyong ya go tsamaisa secretory ke potso ya motheo e e sa bolong go nna teng e e iseng e arabiwe. Mona, re etsa 3D ka nako e le nngwe mebala e mengata e phahameng-qeto ea nako ea sebele ditshwantsho ho paka ka vivo hore e sa tsoa hlahiswa glycosylphosphatidylinositol-immobilized diprotheine le nako e telele haholo ceramide lipid dikarolo di kopantswe le arotswe ka endoplasms khethehileng Net fapaneng transmbrane protheine ho tloha sebakeng seo, e leng. Mo godimo ga moo, re bontsha gore boleele jwa ketane ya ceramide mo leraleng la reticulum ya endoplasmic bo botlhokwa thata mo go tlhopheng gono ga go tlhaola. Thutopatlisiso ya rona e tlamela ka bosupi jwa ntlha jo bo tlhamaletseng jwa vivo go aroganya dithoto tsa poroteine ​​go ikaegilwe ka boleele jwa ketane ya mafura go nna mafelo a a tlhophilweng a thomelontle mo tseleng ya secretory.
Mo diseleng tsa eukaryotic, diporoteine ​​tse di kopantsweng mo endoplasmic reticulum (ER) di bo di tlhophiwa ka nako ya fa di tsamaisiwa ka tsela ya go ntsha diporoteine ​​gore di isiwe kwa di tshwanetseng go ya gone (1). Mo godimo ga go tlhopha ka go dirisa kobo, go ne go ntse go fopholediwa ka nako e telele gore di-lipid dingwe di ka dira gape jaaka dintlha tsa go tswa tse di tlhophilweng ka go di kopanya mo dikarolong tse di rileng tsa lera tse di rileng tsa diporoteine ​​(2-5). Le fa go ntse jalo, go sa ntse go tlhaela bosupi jo bo tlhamaletseng jwa in vivo go supa mokgwa ono o o ka nnang teng o o theilweng mo dipiding. Gore re kgone go rarabolola bothata jono jwa motheo, re ne ra ithuta mo tomoso kafa diporoteine ​​tse di tlhomamisitsweng tsa glycosylphosphatidylinositol (GPI-AP) di romelwang kwa ntle ka tsela e e farologaneng go tswa kwa ER ka gone. GPI-APs ke mefuta e fapaneng ya diprotheine tsa bokahodimo ba sele tse amanang le mafura ( 6, 7). GPI-AP ke poroteine ​​e e ntshiwang e e gokeletsweng mo matlhareng a a kwa ntle a lera la polasema ka karolo ya glycolipid (tshetledi ya GPI). Ba amogela ditshetledi di le GPI jaaka diphetogo tsa morago ga phetolelo tse di sa fetogeng mo lumeneng ya ER (8). Morago ga go kgomarela, GPI-AP e feta mo sedirisiweng sa Golgi (5, 9) go tswa kwa ER go ya kwa leraleng la polasema. Go nna teng ga ditshetledi di le GPI go dira gore GPI-AP e tsamaisiwe ka go kgaogana le diporoteine ​​tse di tswang mo leraleng (go akaretsa le diporoteine ​​tse dingwe tsa lera la polasema) go tsamaya le tsela ya go tswa (5, 9, 10). Mo diseleng tsa tomoso, di-GPI-AP di kgaoganngwa le diporoteine ​​tse dingwe tse di ntshitsweng mo reticulum ya endoplasmic, mme morago ga moo di phuthelwe mo di-vesicle tse di kgethegileng tse di phuthetsweng ke poroteine ​​e e raraaneng ya kobo II (COPII) (6, 7). Ditlhomamiso tsa thulaganyo eno ya go tlhaola mo thulaganyong ya thomelontle ya ER ga di tlhaloganyesege, mme go fopholediwa gore mokgwa ono o ka tlhoka di-lipid, segolobogolo go bopa sešwa ga karolo ya di-lipid ya tshetledi ya GPI (5, 8). Mo tomeng, go bopiwa sešwa ga mafura a GPI go simolola ka bonako fela fa GPI e sena go kgomarela, mme mo maemong a mantsi, go dira gore ceramide e golagane le esiti ya mafura e e nang le ketane e telele ya khabone e le 26 (C26:0) (11, 12). C26 ceramide ke ceramide e kgolo e e tlhagisiwang ke disele tsa tomoso go fitlha ga jaana. E tlhakanngwa mo ER mme bontsi jwa yone bo romelwa kwa sedirisweng sa Golgi ka di-vesicle tsa COPII (13). The ER thomelontle ya GPI-AP ka ho toba hloka tsoelang pele ceramide tswakana (14, 15), 'me ka lehlakoreng le leng, phetolo ya ceramide ho inositol fosphate ceramide (IPC) ka Golgi sesebediswa itšetlehile ka GPI tshetledi tswakana (16). Dithuto tsa biophysical tse di nang le dimembrane tsa maitirelo di bontshitse gore di-ceramide tsa ketane ya acyl e telele thata di ka kopana go bopa dikarolo tse di rulagantsweng tse di nang le dithoto tse di kgethegileng tsa mmele (17, 18). Dintlha tseno di dira gore go akanngwe gore C26 ceramide le GPI-AP e e nang le C26 ceramide di dirisa dithoto tsa tsone tsa mmele go kopana go nna dikgaolo tse di rulagantsweng kgotsa dikgaolo mo tikologong e e tlhakatlhakaneng ya lera la ER. E bopilwe thata ka di-glycerolipid tse dikhutshwane le tse di sa kgotsofalang (C16:1 le C18:1) (19, 20). Dikgaolo tseno di tla tlhopha tsepamisitswe mo mafelong a a rileng a go tswa ga ER (ERES), moo ceramide le GPI-AP e e theilweng mo ceramide di ka rwalelwang mmogo go ya kwa Golgi mo vesicle e le nngwe e e ineetseng ya COPII (5).
Mo thutong eno, re lekile ka tlhamalalo mokgwa ono o o theilweng mo dipiding ka go dirisa maekerosekopo ya go tsaya ditshwantsho ya nako ya mmatota ya confocal ya resolushene e e kwa godimo (SCLIM), e leng mokgwa wa maemo a a kwa godimo wa go tsaya ditshwantsho o o kgonang go ela tlhoko ka nako e le nngwe diporoteine ​​tse di tshwailweng ka fluorescent Disele tsa mebala e meraro le tsa dikarolo tse tharo di na le ditshwantsho tse di nang le resolution e e kwa godimo (3D) (21, 22).
Re ne ra dirisa thekenoloji ya SCLIM pele go tlhalosa go ya pele kafa GPI-AP e e tlwaelegileng e e nang le setlhopha sa C26 ceramide e neng ya tlhatlhobiwa ka gone go tswa mo diporoteineng tse di ntshitsweng mo leraleng morago ga go tswa mo ER mo S. cerevisiae. Gore re kgone go tlhola go aroganngwa ga ER, re ne ra dirisa thulaganyo ya dijini e e kgonang go bona ka tlhamalalo dithoto tse di sa tswang go tlhamiwa tse di tsenang mo ERES mo vivo (7, 23). E le thoto, re ile ra kgetha C26 ceramide e thehiloeng GPI-AP Gas1 e ngotsweng ka protheine e tala e phatsimang (GFP) le protheine e ntshitsweng ka transmembrane Mid2 e ngotsweng ka protheine e phatsimang e haufi le infrared (iRFP), tseo ka bobedi di lebileng lera la polasema (24-26). Mo phetogong e e bosisi ya themperetšha ya sec31-1, dithoto tse pedi tseno di tlhagisiwa ka fa tlase ga motlhotlheletsi yo o tlhotlhelediwang ke galactose le letshwao la ERES le le bopang. Ka themperetšha e e feteletseng (37°C), ka gonne phetogo ya sec31-1 e ama tiro ya karolo ya kobo ya COPII Sec31 go thibela go mela ga COPII le thomelontle ya ER, dithoto tse di sa tswang go tlhakanngwa di kokoana kwa ER (23). Morago ga go tsidifala go fitlha kwa themphereitšheng e e kwa tlase (24°C), disele tse di fetogileng tsa sec31-1 di ne tsa fola mo lefelong la secretory, mme morwalo o mosha wa maitirelo o o neng o kokoantswe o ne wa simolola go romelwa kwa ntle go tswa kwa ER. Pono ya CLIM e bontshitse gore bontsi jwa Gas1-GFP le Mid2-iRFP tse di sa tswang go tlhamiwa di ne di santse di kokoane mo ER ya disele tsa sec31-1 tse di fetogang morago ga go tlhotlhorega kwa 37°C mme morago ga moo tsa gololwa kwa 24°C metsotso e le 5 (Setshwantsho 1). Ka ge Mid2-iRFP e anamisiwa mo leraleng lotlhe la ER, mme Gas1-GFP e tsepamisitswe le go kokoanngwa mo lefelong la lera la ER le le sa tsweleleng, kabo ya tsone e farologane gotlhelele (Setshwantsho 1, A go ya go C le Filimi S1). Mo godimo ga moo, jaaka go bontshitswe mo Setshwantshong 1D, setlhopha sa Gas1-GFP ga se na Mid2-iRFP. Dipholo tseno di supa gore diporoteine ​​tsa GPI-AP le tsa transmembrane di ne tsa kgaoganngwa go nna dikgaolo tse di farologaneng tsa lera la ER go sa le gale. Setlhopha sa Gas1-GFP se bapile le ERES e e rileng e e kwadilweng ka poroteine ​​ya mCherry ya COPII ya kobo Sec13 (Setshwantsho 1, E le F, le filimi S1) (23).
disele tsa sec31-1 di tlhagisa ditlhagiswa tse di tlhotlhelediwang ke galactose, ketane e telele ya acyl (C26) ceramide GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, tala) le poroteine ​​e e fetang mo leraleng la Mid2-iRFP (TMP, pududu) mme go tshwaya gono ga ERES go go Agang go ne ga kwalwa kwa Sec13-mCherry ka metsotso, ya sutisediwa kwa 24°C, mme ya tsewa ditshwantsho ke SCLIM metsotso e le 5 moragonyana. (A go ya go C) e bontsha setshwantsho se se kopantsweng kgotsa se le sengwe sa 2D sa sefofane (A), setshwantsho sa 2D sa dikarolo tsa z di le 10 (B) kgotsa setshwantsho sa hemisphere ya sele sa 3D sa dithoto le ditshwai tsa ERES (C). Bara ya sekala 1μm (A le B). Yuniti ya sekala ke 0.551μm (C). Gas1-GFP e ne ya lemogwa mo dikgaolong tse di farologaneng tsa ER kgotsa mo ditlhopheng, fa Mid2-iRFP e ne ya lemogiwa le go anamisiwa mo leraleng lotlhe la ER (C). (D) Kerafo e bontsha maatla a a amanang a go phatsima ga Gas1-GFP le Mid2-iRFP mo setlhopheng sa Gas1-GFP go bapa le mola o mosweu wa motsu (ka fa molemeng). AU, yuniti e e sa tlhomamang. (E le F) di emela setshwantsho sa 3D se se kopanyang dithoto le letshwao la ERES. Ditlhopha tsa Gas1-GFP di ne tsa lemogiwa gaufi le ERES e e rileng. Yuniti ya sekala ke 0.551μm. (F) Motsu o mosweu o o tiileng o tshwaya setlhopha sa Gas1-GFP se se amanang le ERES. Diphanele tse di fa gare le tse di kafa mojeng di bontsha setshwantsho sa 3D se se godisitsweng se se kopantsweng le pono e e dikologang ya setlhopha sa Gas1-GFP se se tlhophilweng.
Kamano e e gaufi ya sebaka magareng ga setlhopha sa Gas1-GFP le ERES e e rileng e supa gore Gas1-GFP e ka tsena mo ERES e e tlhophilweng, e e farologaneng le go tlhopha go go dirisiwang ke Mid2-iRFP go tswa mo ER. Go samagana le kgonagalo e, re ne ra lekanya tekanyetso ya ERES ya thoto e le nngwe kgotsa di le pedi fela (Setshwantsho 2, A go ya go C). Re fitlhetse gore bontsi jwa di-ERES (70%) di na le mofuta o le mongwe fela wa dithoto. Setshwantsho se se kwa tlase sa Setshwantsho 2C se bontsha dikao tse pedi tse di tlwaelegileng tsa ERES tse di nang le Gas1-GFP fela (Setshwantsho 1) kgotsa Mid2-iRFP fela (Setshwantsho 2). Go farologana, mo e ka nnang 20% ​​ya ERES e na le dithoto tse pedi tse di kopanang mo lefelong le le lengwe. Go fitlhetswe gore di-ERES dingwe (10%) di na le mefuta e mebedi ya dithoto, mme di ne di kgaogantswe mo mafelong a a farologaneng sentle. Ka jalo, tshekatsheko eno ya dipalopalo e bontsha gore morago ga gore ER e romelwe kwa ntle, GPI-AP Gas1-GFP le thoto ya transmembrane Mid2-iRFP di kgaogantswe ka di-ERES tse di farologaneng (Setshwantsho 2D). Bokgoni bona ba ho hlophisa bo dumellana haholo le tlhahlobo e fetileng ya biochemical (6) le boikemisetso ba sebopeho (7). Re ka ela tlhoko gape maitsholo a dithoto tse di kwarantinilweng tse di tsenang mo ERES (Setshwantsho 2E le Filimi S2). Setshwantsho sa 2E se bontsha gore ke karolo e nnye fela ya Gas1-GFP (phanele 3) kgotsa Mid2-iRFP (phanele 4) e e tsenang mo ERES go tswa kwa letlhakoreng le lengwe mme e tswaletswe mo lefelong le le kgaoganeng. Phanele ya 5 ya Setshwantsho sa 2E e bontsha gore Gas1-GFP le Mid2-iRFP ka dinako tse dingwe di fitlhelwa mo ERES e le nngwe, fela di tsena go tswa kwa matlhakoreng a a farologaneng mme di tsepamisitswe mo dikgaolong tse di farologaneng tse di ka emelang di-vesicle tse di farologaneng tsa COPII. Re boetse re netefaditse hore karohano e lemohilweng le ho arolwa ha C26 ceramide e thehilweng hodima GPI-AP Gas1 e le ERES e kgethilweng e ikgethileng hobane thoto e nngwe ya ho ntsha transmembrane, protheine ya lera la polasema e tshwailweng ka GFP Axl2 (27 ), e bontshang boitshwaro bo tshwanang le ba Mid2-iRFP. (Setshwantsho S1 le Filimi S3). Axl2-GFP e e sa tswang go tlhamiwa e anamisiwa ka lera la ER jaaka Mid2-iRFP (Setshwantsho S1, A le B), mme e kopanngwa le Mid2-iRFP mo di-ERES tse dintsi (Setshwantsho S1, B go ya go D). Diphanele 1 le 2 tsa Setshwantsho 1. S1C e bontsha dikao tse pedi tse di tlwaelegileng tsa ERES moo dithoto tse pedi tsa transmembrane di kopanang. Mo mabakeng ano, dithoto ka bobedi di tsena mo ERES mmogo (Setshwantsho S1E, Phanele 3 le Filimi S3).
Disele tsa sec31-1 tse di tlhagisang ditlhagiswa tse di sa kgoneng go tlhotlhelediwa ke galactose, Gas1-GFP (GPI-AP, tala) le Mid2-iRFP (TMP, botala jwa loapi) le ERES e e bopang e e tshwayang Sec13-mCherry (ERES, magenta) di ne tsa bewa kwa 37 Morago ga go tlhotlhora sephiri go ya go °C metsotso e le 30. boloko, le setshwantsho ka SCLIM morago ga metsotso e le 20. (A go ya go C) Ditshwantsho tsa tekanyetso tsa 2D tse di emelang (A; bara ya sekale, 1μm) kgotsa ditshwantsho tsa hemisphere ya sele ya 3D (B le C; yuniti ya sekale, 0.456μm) tsa dithoto le dikarolo di le 10 tsa z tse di tshwailweng ke ERES. Phanele e e kwa tlase mo go (B) le phanele mo go (C) di bontsha ditshwantsho tse di dirilweng go bontsha fela dithoto tse di leng teng mo ERES (botala jo bo letlhololo) [Gas1-GFP (botala jo bo tseneletseng) le Mid2-iRFP (botala jo bo botlhofo)]. (C) Motsu o o bulegileng: ERES e rwala morwalo o le mongwe fela (1 go ya go 4). Motsu o motala: ERES e na le dithoto tse di kgaogantsweng (5). Motsu o mosweu o o tiileng: ERES e e nang le dithoto tse di beilweng mmogo. Fa tlase: ERES e le nngwe e e tlhophilweng e na le fela Gas1-GFP (1) kgotsa Mid2-iRFP (2). Bara ya sekala, 100 nm. (D) Go lekanyetsa selekanyo sa fotomaekrokerafo e e tlhalosiwang mo go (C). Palogare ya phesente ya ERES e e nang le morwalo o le mongwe fela (Gas1-GFP kgotsa Mid2-iRFP), morwalo o o kgaogantsweng le morwalo o o tshwaraganeng. Mo ditekong tse tharo tse di ikemetseng, n=432 mo diseleng di le 54. Bara ya phoso = SD. Teko ya t e e sa kopaneng ya mesela e mebedi. *** P = 0,0002. (E) Setshwantsho sa 3D sa ERES e e tlhophilweng ya dithoto tse di kwarantinilweng tse di tshwailweng ka (C). Gas1-GFP (tala) (3) kgotsa Mid2-iRFP (botala jwa loapi) (4) e tsena mo ERES (botala jwa loapi) go tswa kwa letlhakoreng le lengwe mme e lekanyeditswe go lefelo le lennye mo teng ga ERES. Ka dinako tse dingwe, mefuta eno ka bobedi ya dithoto e tsena mo ERES e le nngwe (5) go tswa kwa letlhakoreng le le lengwe mme e tswaleletswe mo lefelong le le kgaoganeng mo teng ga ERES. Bara ya sekala, 100 nm.
Morago ga moo, re ne ra leka kgopolo ya gore ceramide e telele ya ketane ya acyl (C26) e e leng teng mo leraleng la ER e kgweetsa go kopana le go tlhopha ga Gas1 go nna ERES e e tlhophilweng. Go fitlhelela seno, re ne ra dirisa mofuta wa tomoso o o fetotsweng wa GhLag1, o mo go one di-synthase tse pedi tsa ceramide tsa endogenous Lag1 le Lac1 di neng tsa emisediwa ka GhLag1 (homolog ya Lag1 ya letseta), mme seno sa felela ka mofuta wa tomoso o o nang le mofuta wa Ceramide wa lera la sele o o khutshwane go feta mofuta wa naga (Setshwantsho 3A) (2). Tshekatsheko ya spectrometry ya bokete (MS) e bontshitse gore mo mefuteng ya mofuta wa naga, 95% ya palogotlhe ya seramide ke seramide sa ketane e telele thata (C26), fa mo GhLag1, 85% ya seramide e le telele thata (C18 le C16). ), ke fela 2% ya seramite e e telele thata (C26) ketane ya seramide. Le fa di-ceramide tsa C18 le C16 e le tsone di-ceramide tse dikgolo tse di lemogilweng mo leraleng la GhLag1 go fitlha ga jaana, tshekatsheko ya MS gape e netefaditse gore tshetledi ya GPI ya Gas1-GFP e e tlhagisitsweng mo mofuteng wa GhLag1 e na le ceramide ya C26, e e ka bapisiwang le di-lipid tsa mofuta wa naga. Boleng bo a tshwana (Setshwantsho 3A) (26). Ka jalo, seno se raya gore enzyme ya go bopa sešwa ga ceramide Cwh43 e tlhopha thata ceramide ya C26, jaaka go bontshitswe mo Setshwantshong 26, e rata go akaretsa tshetledi ya GPI go tswa mo selekanyong se sennye sa ceramide ya C26 mo mofuteng wa GhLag1. S2 (29). Le fa go ntse jalo, lera la sele la GhLag1 tota le na le ceramide ya C18-C16 fela, fa Gas1-GFP e sa ntse e na le ceramide ya C26. Ntlha eno e dira gore mofuta ono e nne sedirisiwa se se siameng go rarabolola bothata jwa boleele jwa ketane ya acyl ya ceramide ya lera mo ER. Seabe sa kakanyo sa setlhopha le go tlhopha. Ka nako eo, re ile ra qala ho ithuta bokgoni ba C26 Gas1-GFP ho bokella ka dihlopha ka GhLag1 le mocheso-bosisi fetohang allele ya sec31-1 ka tlwaelehileng fluorescence maekerosekopo, moo feela nako e telele (C18-C16) ketane e teng ka ER lera Ceramide (Setshwantsho 3). Re lemogile gore mo sec31-1, bontsi jwa Gas1-GFP bo ne bo tsepamisitswe mo ditlhopheng, fa Gas1-GFP mo sec31-1 GhLag1 e e nang le lera le le telele (C18-C16) le le telele la ceramide ER e ne e sa kgobokane thata le go anamisiwa mo Mo leraleng lotlhe la ER. Go nna nepo, ka gonne go kopana ga ditlhopha go go theilweng mo ceramide ya C26 go amana thata le ERES e e rileng (Setshwantsho 1), re ne ra batlisisa morago ga moo gore a thulaganyo eno e ka akaretsa gape le tiro ya mokgwa wa go romela poroteine ​​ya ER kwa ntle. GPI-AP e sebedisa tsamaiso e kgethehileng ya COPII bakeng sa thomelontle ya ER, e laolwang ka mafolofolo ke ho fetolwa ha sebopeho sa Ted1 sa karolo ya glycan ya tshetledi ya GPI (30, 31). GPI-glycan e e kopantsweng sešwa e lemogwa ke p24 e e raraaneng ya moamogedi wa dithoto tsa transmembrane, e e thapang Lst1 ka go tlhopha, e leng isoform e e rileng ya yuniti e kgolo e e tlamang dithoto tsa COPII ya Sec24, e e bopang COPII Vesicles e e humileng ka GPI-AP-31 di a tlhokega (31). Ka jalo, re ne ra aga phetogo e e gabedi e e neng ya kopanya go phimolwa ga diporoteine ​​tseno tse di le nosi (karolo e e raraaneng ya p24 Emp24, enzyme ya go bopa sešwa ya GPI-glycan Ted1 le subunit e e rileng ya COPII Lst1) le mofuta wa phetogo ya sec31-1, mme ra di ithuta A go a kgonega go bopa GFP1-clu3). Re lemogile gore mo go sec31-1emp24Δ le sec31-1ted1Δ, Gas1-GFP ga e a kgobokana thata e bile e anamisitswe mo leraleng lotlhe la ER, jaaka go bonwe mo nakong e e fetileng mo go sec31-1 GhLag1, fa mo go sec31-1lst1Δ, Gas1-GFP e tshwana le sec3. Dipholo tseno di supa gore mo godimo ga go nna teng ga C26 ceramide mo leraleng la ER, go kgobokana ga Gas1-GFP le gone go tlhoka go tshwaragana le p24 complex, mme ga go tlhoke go thapiwa go go rileng ga Lst1. Go tswa foo, re ne ra sekaseka kgonagalo ya gore boleele jwa ketane ya ceramide mo leraleng la ER bo ka laola go bofa ga Gas1-GFP go p24. Le fa go ntse jalo, re fitlhetse gore go nna teng ga C18-C16 ceramide mo leraleng ga go ame di-GPI-glycan tse di agilweng sešwa ke p24 complex (Ditshwantsho S3 le S4, A le B) kgotsa go tlama GPI-AP le go romela GPI-AP kwa ntle. bokgoni. Thapa mofutapotlana wa COPII Lst1 (Setshwantsho S4C). Ka jalo, go kopana go go ikaegileng ka C26 ceramide ga go tlhoke ditirisano tsa poroteine ​​le mekgwa e e farologaneng ya go romela poroteine ​​ya ER kwa ntle, mme go tshegetsa mokgwa o mongwe wa go tlhopha o o kgweediwang ke boleele jwa mafura. Go tswa foo, re ne ra sekaseka gore a boleele jwa ketane ya ceramide acyl mo leraleng la ER bo botlhokwa mo go tlhaoleng Gas1-GFP ka tsela e e nang le matswela jaaka ERES e e tlhophilweng. Ka ge Gas1 mo mofuteng wa GhLag1 o o nang le ceramide ya ketane e khutshwane e tswa mo ER mme e tsena mo leraleng la polasema (Setshwantsho S5), re dumela gore fa go tlhophiwa go kgweediwa ke boleele jwa ketane ya ceramide acyl, Gas1 mo mofuteng wa GhLag1 e ka kaelwa gape le go kgabaganngwa. ERES thepa le lera tšoanang.
(A) Lera la sele la GhLag1 le na le di-ceramide tse khutshwane tsa C18-C16, fa tshetledi ya GPI ya Gas1-GFP e santse e na le IPC e e tshwanang ya C26 jaaka disele tsa mofuta wa naga. Fa godimo: tshekatsheko ya boleele jwa ketane ya acyl ya ceramide mo leraleng la sele la mefuta ya mofuta wa naga (Wt) le GhLag1p ka spectrometry ya bontsi (MS). The ya data emela peresente ya palo yohle ceramide. Palogare ya diteko tse tharo tse di ikemetseng. Bara ya phoso = SD. Teko ya t e e sa kopaneng ya mesela e mebedi. **** P <0,0001. Phanele e e kwa tlase: Tshekatsheko ya MS ya boleele jwa ketane ya acyl ya IPC e e leng teng mo tshetleding ya GPI ya Gas1-GFP (GPI-IPC) e e tlhagisiwang mo mefuteng ya mofuta wa naga le ya GhLag1p. The ya data emela peresente ya palo yohle IPC pontšo. Palogare ya ditekelelo tse tlhano tse di ikemetseng. Bara ya phoso = SD. Teko ya t e e sa kopaneng ya mesela e mebedi. ns, ga se botlhokwa. P = 0,9134. (B) Dimaekerokerafo tsa fluorescence tsa disele tsa sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ le sec31-1lst1Δ disele tse di tlhagisang Perform ya Gas1-GFP e e tlhotlhelediwang ke galactose di ne tsa tlhokomelwa ka 37 ° C go ya kwa tlase ka metsotso e e fetisang. morago ga 24°C. Motsu o mosweu: Setlhopha sa ER Gas1-GFP. Motsu o o bulegileng: Gas1-GFP e e sa kgobokanngwang e anamisiwa mo leraleng lotlhe la ER, e bontsha go tshwaiwa ga lesale la nyutlelia le le tlwaelegileng la ER. Bara ya sekale, 5μm. (C) Go lekanya selekanyo sa fotomaekrokerafo e e tlhalosiwang mo go (B). Palogare ya peresente ya disele tse di nang le sebopego sa Gas1-GFP sa punctate. Mo ditekong tse tharo tse di ikemetseng, disele tsa n≥300. Bara ya phoso = SD. Teko ya t e e sa kopaneng ya mesela e mebedi. **** P <0,0001.
Go rarabolola bothata jono ka tlhamalalo, re ne ra dira pono ya SCLIM ya Gas1-GFP le Mid2-iRFP mo GhLag1 e e nang le allele e e fetogang e e bosisi mo mogoteng wa sec31-1 (Setshwantsho 4 le Filimi S4). Morago ga gore ER e bolokwe kwa 37°C mme morago ga moo e gololwe kwa 24°C, bontsi jwa Gas1-GFP e e sa tswang go tlhamiwa e ne e sa kgobokane le go anamisiwa mo leraleng lotlhe la ER, jaaka go lemogilwe ka dimaekerosekopo tse di tlwaelegileng (Setshwantsho 4, A le B ). Mo godimo ga moo, phesente e kgolo ya ERES (67%) e akaretsa mefuta e mebedi ya dithoto tse di leng mmogo mo go yone (Setshwantsho 4D). Diphanele 1 le 2 tsa Setshwantsho 4C di bontsha dikao tse pedi tse di tlwaelegileng tsa ERES tse di nang le Gas1-GFP le Mid2-GFP tse di kopaneng. Mo godimo ga moo, dithoto ka bobedi di ne tsa thapiwa mo ERES e le nngwe (Setshwantsho 4E, phanele 3 le filimi S4). Ka jalo, dipholo tsa rona di bontsha gore boleele jwa ketane ya ceramide acyl mo leraleng la ER ke selo se se botlhokwa se se laolang go kokoanngwa ga diporoteine ​​tsa ER le go di tlhaola.
Disele tsa Sec31-1 GhLag1 tse di tlhagisang ditlhagiswa tse di tlhotlhelediwang ke galactose, Gas1-GFP (GPI-AP, tala) le Mid2-iRFP (TMP, pududu) le Sec13-mCherry e e tshwailweng ka ERES e e bopang (ERES, mmala o mohibidu) Di tlhotlhorega ka 37°C. Tswelela metsotso e le 30, fologela kwa 24°C go golola ditswa, mme o tseye setshwantsho ka SCLIM morago ga metsotso e le 20. (A go ya go C) Ditshwantsho tsa tekanyetso ya 2D tse di emelang (A; bara ya sekale, 1μm) kgotsa ditshwantsho tsa hemisphere ya sele ya 3D (B le C; yuniti ya sekale, 0.45μm) tsa dikarolo tse 10 tsa z tse di tshwailweng ke dithoto le ERES. Phanele e e kwa tlase mo go (B) le phanele mo go (C) di bontsha ditshwantsho tse di dirilweng go bontsha fela dithoto tse di leng teng mo ERES (botala jo bo letlhololo) [Gas1-GFP (botala jo bo tseneletseng) le Mid2-iRFP (botala jo bo botlhofo)]. (C) Motsu o o tletseng o mosweu: ERES, dithoto di a tshwaragana. Motsu o o bulegileng: ERES e na le ntlha e le nngwe fela. Phanele e e kwa tlase: ERES e e tlhophilweng e na le dithoto tse di tshwaraganeng (1 le 2) tse di tshwailweng mo go (C). Bara ya sekala, 100 nm. (D) Go lekanyetsa selekanyo sa fotomaekrokerafo e e tlhalosiwang mo go (C). Mo diyuniting tsa sec31-1 le sec31-1 GhLag1, go akareditswe morwalo o le mongwe fela (Gas1-GFP kgotsa Mid2-iRFP), le palogare ya phesente ya ERES ya morwalo o o kgaoganeng le morwalo o o tshwaraganeng. Mo ditekong tse tharo tse di ikemetseng, n = 432 mo diseleng di le 54 (karolo31-1) le n = 430 mo diseleng di le 47 (karolo31-1 GhLag1). Bara ya phoso = SD. Teko ya t e e sa kopaneng ya mesela e mebedi. *** P = 0,0002 (karolo 31-1) le ** P = 0,0031 (karolo 31-1 GhLag1). (E) Setshwantsho sa 3D sa ERES e e tlhophilweng e e nang le dithoto tse di tshwaraganeng (3) tse di tshwailweng mo go (C). Gas1-GFP (tala) le Mid2-iRFP (botala jwa loapi) di atamela ERES (botala jwa loapi) go tswa mo letlhakoreng le le lengwe mme di nna mo lefelong le le lengwe le le thibetsweng la ERES. Bara ya sekala, 100 nm.
Thutopatlisiso eno e tlamela ka bosupi jo bo tlhamaletseng jwa vivo jwa gore dithoto tsa poroteine ​​tse di theilweng mo mafureng di arogantswe go nna mafelo a a tlhophilweng a thomelontle mo tseleng ya secretory, mme e senola botlhokwa jwa boleele jwa ketane ya acyl mo go tlhopheng ga go aroganngwa. Ka go dirisa mokgwa o o maatla le wa maemo a a kwa godimo wa go sekaseka maekerosekopo o o bidiwang SCLIM, re ne ra bontsha Gas1-GFP e e sa tswang go tlhamiwa (lera le legolo la polasema la GPI-AP le le nang le karolo e telele thata ya ketane ya acyl (C26) ceramide lipid) mo tomoso ) Dikgaolo tse di kgobokaneng mo diporoteineng tse di kgethegileng tsa transmbrame di amana le di-ER tse di rileng tsa transmbrame, di amana le lera la ER (Setshwantsho 1). Mo godimo ga moo, mefuta e mebedi eno ya dithoto e tsena mo ERES e e farologaneng ka go tlhopha (Setshwantsho 2). Boleele jwa ketane ya acyl ya ceramide ya disele mo leraleng bo fokoditswe go tswa go C26 go ya go C18-C16, setlhopha sa Gas1-GFP se kgoreletsega go nna kgaolo e e farologaneng ya ER, mme Gas1-GFP e fetolwa tsela go tswa mo ER ka poroteine ​​ya transmembrane ka ERES e e tshwanang (Setshwantsho 3 le Setshwantsho3). 4).
Le fa GPI-AP e dirisa mokgwa o o kgethegileng wa poroteine ​​go tswa mo ER, re fitlhetse gore kgaogano e e ikaegileng ka C26 ceramide ga e ikaege ka ditirisano tsa poroteine ​​tse di farologaneng tse di ka lebisang kwa go kgethegeng ga ERES (Ditshwantsho S4 le S5). Go na le moo, diphitlhelelo tsa rona di tshegetsa mokgwa o mongwe wa go tlhaola o o kgweediwang ke go kgobokanya diporoteine ​​tse di theilweng mo mafureng le go kgaphelwa thoko ga dithoto tse dingwe morago ga moo. Ditemogo tsa rona di supa gore kgaolo ya Gas1-GFP kgotsa setlhopha se se amanang le ERES e e rileng ga se na poroteine ​​e e tswang mo leraleng la Mid2-iRFP, e e bontshang gore setlhopha sa GPI-AP se se ikaegileng ka C26 ceramide se tla tlhofofatsa go tsena ga bone mo ERES e e maleba, mme ka nako e e tshwanang, se kgaphetse kwa thoko di-transmembrane tseno le TheFig1 2). Go farologana, go nna teng ga di-ceramide tsa C18-C16 mo ​​leraleng la ER ga go dire gore GPI-AP e bope dikgaolo kgotsa ditlhopha, ka jalo ga di kgaphe kwa thoko kgotsa go emisetsa diporoteine ​​tse di ntshitsweng tsa transmembrane mo ERES e e tshwanang (Ditshwantsho 3 le 4). . Ka jalo, re tshitshinya gore C26 ceramide e kgweetsa go kgaoganngwa le go tlhaolwa ka go tlhofofatsa go kgobokana ga diporoteine ​​tse di golagantsweng le ERES e e rileng.
Tsela ya go fitlhelela go kgobokana gono go go ikaegileng ka ceramide ya C26 mo lefelong le le rileng la ER? Tlwaelo ya ceramide ya lera ya go kgaogana ka fa thoko e ka dira gore GPI-AP le C26 ceramide di bope dilipidi tse dinnye le tse di rulagantsweng ka ponyo ya leitlho mo tikologong ya mafura e e sa tlhomamang thata ya lera la ER le le nang le di-glycerolipid tse dikhutshwane le tse di sa kgotsofalang. Ditlhopha tsa boleng (17, 18). Ditlhopha tseno tse dinnye tsa nakwana di ka kopanngwa gape go nna ditlhopha tse dikgolo, tse di tlhomameng morago ga go tlama mo p24 complex (34). Go tsamaelana le se, re bontshitse gore C26 Gas1-GFP e tlhoka go dirisana le p24 complex go bopa ditlhopha tse dikgolo tse di bonalang (Setshwantsho 3). The p24 rarahaneng ke heterozygous oligomer bopilwe ka tse 'nè tse fapaneng tsa p24 transmembrane diprotheine tse ka tomoso (35), e leng e fana ka multivalent tlama, e leng e ka lebisa ho sefapano-hokahanyang ha tse nyenyane GPI-AP dihlopha, ka tsela eo ho hlahisa e khōloanyane Tsepameng sehlopha (34). Tirisanommogo magareng ga di-ectodomain tsa poroteine ​​tsa di-GPI-AP le tsone di ka nna le seabe mo go kopanyeng ga tsone, jaaka go bontshitswe ka nako ya dipalangwa tsa tsone tsa Golgi mo diseleng tsa epithelial tse di arogantsweng tsa diamusi (36). Le fa go ntse jalo, fa C18-C16 ceramide e le teng mo leraleng la ER, fa p24 complex e golagana le Gas1-GFP, ga go kitla go bopega ditlhopha tse dikgolo tse di farologaneng. Mokgwa o o ka fa tlase o ka ikaega ka dipharologantsho tse di rileng tsa mmele le tsa khemikhale tsa ceramide e telele ya ketane ya acyl. Dithuto tsa biophysical tsa dimembrane tsa maitirelo di bontsha gore le fa di-ceramide tsa ketane ya acyl e telele (C24) le e khutshwane (C18-C16) di ka baka kgaogano ya legato, ke fela di-ceramide tsa ketane e telele ya acyl (C24) tse di ka rotloetsang Curvature e e kwa godimo le go koba ga filimi go bopa filimi sešwa. Ka go dirisana mmogo (17, 37, 38). Go bontshitswe gore helix ya TMED2 e e fetang mo leraleng, e leng homologue ya motho ya Emp24, e dirisana ka go tlhopha le sphingomyelin e e theilweng mo ceramide ya C18 mo di-lobule tsa cytoplasmic (39). Ka go dirisa ditshwantsho tsa diphetogo tsa dimolekhule (MD), re fitlhetse gore di-ceramide tsa C18 le C26 ka bobedi di kokoana go dikologa di-lobule tsa cytoplasmic tsa helix ya transmembrane ya Emp24, mme di na le dikgatlhego tse di tshwanang (Setshwantsho S6). Ke habohlokoa ho hlokomela hore sena se bontša hore helix ea transmembrane ea Emp24 e ka lebisa ho kabo e sa lekalekaneng ea lipids ka lera. Se ke dipholo tsa bosheng tse di theilweng mo diseleng tsa diamusi. Ditshwantsho tse di tshwanang tsa MD le tsone di bontsha go nna teng ga dilipidi tsa ether ( 40 ) . Ka jalo, re fopholetsa gore C26 ceramide mo di-lobule tse pedi tsa ER26 e humisitswe mo lefelong la gaeno. Fa GPI-AP mo di-lobule tsa luminal e tshwaragana ka tlhamalalo le p24 e e nang le dikarolo tse dintsi le go kokoanngwa ga C26 ceramide go dikologa p24 mo di-lobuleng tsa cytoplasmic, e ka rotloetsa go kopana ga Poroteine ​​e e tsamayang le yone le go kopana ga lera go tlhagisiwa ka menwana (41), mme seno se dira gore GPI-AP e kgaogane go nna kgaolo e e kwa godimo dikgaolo tsa lera la ER (42). Dipegelo tse di fetileng di ne di tshegetsa mokgwa o o tshitshintsweng (43, 44). Go bofa ga di-oligolectin, diphagocyte kgotsa dilwantsha-ditwatsi tsa di-glycosphingolipid (GSL) tse di theilweng mo ceramide mo leraleng la polasema go dira gore go nne le kokoano e kgolo ya GSL, go tokafatsa go kgaogana ga legato mme go baka go senyega ga lera le go tsena mo teng (44). Iwabuchi jj.
Mo diseleng tsa epithelial tse di polarized tsa diamusi, go tsepamisa mogopolo ga mafaratlhatlha a a lwantshanang le Golgi (TGN) go ya kwa maemong a lera la polasema ya apical go laola go kgaoganngwa le go tlhophiwa ga GPI-AP (10, 45). Kokoanyo eno e kgweediwa ke oligomerization ya GPI-AP (36), mme gape e ka ikaega ka boleele jwa ketane ya ceramide e re e bonang mo tomeng. Le fa GPI-AP ya diamusi e na le tshetledi e e theilweng mo di-lipid tsa ether, mme popego ya yone ya khemikhale e farologane thata le ceramide ya ketane e telele thata ya acyl, patlisiso ya bosheng e fitlhetse gore di-lipid ka bobedi di na le dithoto tse di tshwanang tsa mmele le tsa khemikhale le tiro (40). Ka jalo, karolo ya ether lipid mo diseleng tsa diamusi e ka tshwana le C26 ceramide mo tomeng, mme seabe sa yona ke go amana le ceramide ya ketane e telele mo leraleng go rotloetsa go kokoanngwa le go tlhaolwa ga GPI-AP. Le fa kgonagalo e e santse e tlhoka go lekwa ka tlhamalalo, diphitlhelelo tse di fetileng di tshegetsa gore go tsamaisiwa ga ceramide ya ketane e telele ya acyl go ya kwa mmeleng wa Golgi ga go dirwe ke diporoteine ​​tsa phetiso ya cytoplasmic, mme go ikaegile ka tshwaragano ya ditshetledi di le dintsi tsa GPI jaaka tomoso. Ka jalo, mokgwa wa go boloka thutotlhagelelo o lebega o kgona go tsamaisa mmogo ka go tlhopha ceramide ya ketane e telele thata ya acyl le GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) mo vesicle e le nngwe ya dipalangwa.
Mo dithulaganyong tsa disele tsa epithelial tsa tomoso le tsa diamusi, go kopana ga GPI-AP le go kgaogana le diporoteine ​​tse dingwe tsa lera la polasema tsotlhe di diragala pele di fitlha kwa godimo ga sele. Paladino le ba bangwe. (48) fumane hore ka TGN ya disele tsa epithelial polarized tsa diamusi, ho kopana ha GPI-AP ha ho hlokahale feela bakeng sa ho arolwa ka ho kgetha ha GPI-APs ho lera la plasma la apical, empa hape ho laola mokgatlo wa ho kopanya wa GPI-APs le mosebetsi wa yona wa diphedi. Boalo jwa sele. Mo tomoso, thutopatlisiso eno e bontshitse gore setlhopha sa GPI-AP se se ikaegileng ka C26 ceramide mo ER se ka laola thulaganyo ya setlhopha le tiro e e dirang ya GPI-AP mo leraleng la polasema (24, 49). E lumellana le mohlala ona, disele tsa GhLag1 di alejiki ho GPI inhibitors kapa lithethefatsi tse amang botšepehi ba lebota la sele (28), mme tlhokeho ya dihlopha tse sebetsang tsa Gas1-GFP (49) tsa ntlha ceramide e bontshitsweng ho nyalana ha disele tsa tomoso e bontsha G Ditlamorao tse ka kgonehang tsa mmele tsa hLag1. Phoso ya GPI-AP. Le fa go ntse jalo, go dira diteko tse dingwe tsa gore a thulaganyo e e dirang ya boalogodimo jwa sele e rulagantswe go tswa mo ER ka mokgwa wa go tlhaola o o theilweng mo boleeleng jwa mafura e tla nna setlhogo sa patlisiso ya rona ya mo isagweng.
Mefuta ya Saccharomyces cerevisiae e e dirisitsweng mo tirong e e kwadilwe mo Lenaneong S1. Mefuta ya MMY1583 le MMY1635 ya SCLIM ya go tsaya ditshwantsho tsa disele tse di tshelang e ne ya agiwa mo lemoragong la W303. Mefuta ena e hlahisang Sec13-mCherry e nang le theke ya protheine e phatsimang e ne e hahilwe ka ho sebedisa mokgwa o thehilweng hodima tsibogo ya ketane ya polymerase (PCR) e nang le plasmid ya pFA6a e le thempoleite (23). Mofuta o o tlhagisang Mid2-iRFP o o tshwailweng ka poroteine ​​ya fluorescent ka fa tlase ga taolo ya motlhotlheletsi wa GAL1 o ne wa agiwa ka tsela e e latelang. Go okediwa ga tatelano ya iRFP-KanMx ka PCR go tswa mo setsheding sa pKTiRFP-KAN (mpho ya ga E. O'Shea, nomoro ya polasemiti ya Addgene 64687; Morago ga gore tatelano ya jenome ya Mid2-iRFP e godisiwe le go kopisiwa mo motlhotlheletsing wa GAL1, e ne ya kopanngwa mo lefelong la Not I-Sac I la polasemiti ya go kopanya pRS306. Plasmid e e neng ya tswa ka pRGS7 e ne ya tsenngwa mo moleng le Pst I go kopanngwa le locus ya URA3.
Gene ya fusion ya Gas1-GFP e tlhagisiwa ka fa tlase ga taolo ya motlhotlheletsi wa GAL1 mo polasemiti ya centromere (CEN), e e agilweng ka tsela e e latelang. Tatelano ya Gas1-GFP e ne ya okediwa ka PCR go tswa mo polasemiti ya pRS416-GAS1-GFP ( 24 ) ( mpho ya ga L. Popolo ) mme ya kopisiwa mo lefelong la Xma I–Xho I la polasemiti ya CEN pBEVY-GL LEU2 ( mpho ya ga C ) . Modiri; Nomoro ya polasemiti ya tlaleletso 51225; 51225; RRID: Tlaleletso_51225). Polasemiti e e neng ya tswa e ne ya bidiwa pRGS6. Lefutso la fusion la Axl2-GFP le lona le hlahiswa tlasa taolo ya moetapele wa GAL1 wa vector ya pBEVY-GL LEU2, mme kaho ya yona e ka tsela e latelang. Tatelano ya Axl2-GFP e ne ya godisiwa go tswa mo polasemiti ya pRS304-p2HSE-Axl2-GFP (23) ka PCR, mme ya kopisiwa mo lefelong la Bam HI-Pst I la pBEVY-GL LEU2 vector. Polasemiti e e neng ya tswa e ne ya bidiwa pRGS12. Tatelano ya di-oligonucleotide tse di dirisitsweng mo patlisisong eno e kwadilwe mo Lenaneong S2.
Mofuta o ne o tlaleleditswe ka 0.2% ya adenine le 2% ya sukiri [YP-dextrose (YPD)], 2% ya rafinose [YP-rafinose] e e humileng ka tomoso ya poroteine ​​p (YP) e e magareng (1 % ya tomoso le 2% ya poroteine ​​ept). (YPR)] kgotsa 2% ya galactose [YP-galactose (YPG)] jaaka motswedi wa khabone, kgotsa mo sedirisiweng se se kwa tlase sa maitirelo (0.15% ya motheo wa naeterojene wa tomoso le 0.5% ya ammoniamo sulfate) go tlaleletsa diaminoesiti le dibeise tse di tshwanetseng tse di tlhokegang mo phepong , Mme e e nang le 2% ya sukiri2 ya sukiri (galactose ya maitirelo bonnye magareng) jaaka motswedi wa khabone.
Bakeng sa ditshwantsho tsa nako ya nnete, disele tse fetohang tsa sec31-1 tse bosisi tsa mocheso tse hlahisang kaho tlasa moetapele wa GAL1 di ile tsa hodisiwa ka YPR mahareng ka 24 ° C bosiu ho isa ho mohato wa bohareng ba di-log. Morago ga go tsenngwa mo YPG ka 24°C ura e le 1, disele di ne tsa tlhokomelwa mo SG ka 37°C metsotso e le 30, mme morago ga moo tsa fetisediwa kwa 24°C go gololwa mo bolokong ya go ntsha. Concanavalin A e ne ya dirisiwa go baakanya disele mo selaeteng sa galase mme ya tsewa ditshwantsho ke SCLIM. SCLIM ke motswako wa maekerosekopo ya Olympus IX-71 e e fetotsweng le lense ya oli ya UPlanSApo 100×1.4 (Olympus), thulaganyo ya lebelo le le kwa godimo ya selekanyo sa letshwao-go-modumo se se dikologang sa sekenara sa sepekterometara sa disiki (Yokogawa Electric), sekenara sa ditshwantsho se se itiretsweng (Difotoniki tsa Hamamatsu) e ka tlamela ka thulaganyo ya lense e e godisang e e nang le kgodiso ya bofelo ya ×266.7 le khamera ya sedirisiwa se se kopantsweng le tšhatšhe e e atisang dieleketerone (Difotoniki tsa Hamamatsu) (21). Go tsaya ditshwantsho go dirwa ka serweboleta se se itiretsweng (Yokogawa Electric). Bakeng sa ditshwantsho tsa 3D, re sebedisitse actuator ya piezoelectric e entsweng ka tlwaelo ho thothomisa lense ya sepheo ka tsepamo, mme ra bokella dikarolo tsa mahlo tse 100 nm ka thoko ka mokotla. Setshwantsho sa Z-mokgobo se fetolelwa go nna tshedimosetso ya voxel ya 3D, mme tiro ya go anamisa ntlha ya kgopolo e e dirisiwang mo maekerosekopo ya confocal ya disiki e e dikologang e dirisiwa mo go diriseng tshebetso ya go ntsha di-disc ke sofotewere ya Volocity (PerkinElmer). Ka go dirisa sofotewere ya Volocity go tlhomamisa ka go itirisa go sekaseka lefelo le le kopanetsweng, go ne ga lekanngwa ERES go akaretsa le dithoto. Tshekatsheko ya go sekaseka mela e ne ya dirwa go dirisiwa sofotewere ya MetaMorph (Didiriswa tsa Dimolekhule).
Dirisa serweboleta sa GraphPad Prism go bona botlhokwa jwa dipalopalo. Bakeng sa t-test ya Moithuti ya mesela e mmedi le teko e tlwaelehileng ya tlhahlobo ya tsela e le nngwe ya phapang (ANOVA), diphapang pakeng tsa dihlopha di nkuwa di na le tshusumetso e kgolo ho P <0.05 (*).
Bakeng sa maekerosekopo ya fluorescence ya Gas1-GFP, disele tsa legato la logo di ne tsa hodisiwa bosigo jotlhe mo YPD mme tsa kokoanngwa ka centrifugation, tsa tlhatswiwa gabedi ka phosphate buffered saline, mme tsa tlhokomelwa mo aeseng bonnye metsotso e le 15, mme tsa tswelela ka fa tlase ga maekerosekopo jaaka go tlhalositswe pelenyana (Check24). Maekerosekopo ya Leica DMi8 (HCX PL APO 1003/1.40 oli PH3 CS) e e nang le lense ya setlhogo, setlhotlhi sa L5 (GFP), khamera ya Hamamatsu le serweboleta sa Tiriso ya Suite X (LAS X) se ne sa dirisiwa go bona. .
Disampole di ne tsa fetolwa ka sethibela-sampole sa SDS ka 65°C metsotso e le 10, mme morago ga moo tsa kgaoganngwa ka motlakase wa gel ya SDS-polyacrylamide (PAGE). Bakeng sa tlhahlobo ya immunoblotting, 10 μl ya sampole e ne e laisitswe ka mola. Selwantsha-Gas sa motheo: Dirisa selwantsha-Gas1 sa mmutla ka tlhaolo ya 1:3000, selwantsha-Emp24 sa mmutla ka tlhaolo ya 1:500, le selwantsha-GFP sa mmutla (mpho go tswa go H. Riezman) ka tlhaolo ya 1:3000. Selwantsha-Pgk1 sa peba sa monoclonal se ne sa dirisiwa ka tlhaoloso ya 1:5000 (mpho go tswa go J. de la Cruz). Selwantsha-mogare sa bobedi: Peroxidase ya peroxidase (HRP) e e kopantsweng ya podi e e lwantshanang le mmutla G (IgG) e e dirisiwang ka go tlhatswa ga 1:3000 (Pierce). IgG ya podi e e lwantshanang le peba e e kopantsweng le HRP e ne ya dirisiwa ka tlhaolo ya 1:3000 (Pierce). Lefelo la karabelo ya masole a mmele le ne la lemogiwa ka mokgwa wa go phatsima ga dikhemikhale tsa sedirisiwa sa SuperSignal West Pico (Saense ya Thermo Fisher).
Jaaka go tlhalositswe mo go (31), go ne ga dirwa tekeletso ya tlholego ya immunoprecipitation mo karolwaneng e e humisitsweng ya ER. Ka bokhutshwane, tlhatswa disele tsa tomoso ka sethibela-HCl sa 50 mM (pH 7.5), NaCl ya 150 mM, EDTA ya 5 mM, motswako wa sethibela-protease sa 1 mM) ka 600 nm ( OD600) ka makgetlo a le 100. E ne e thubilwe ka dipheta tsa galase, mme morago ga moo matlakala a sele le dipheta tsa galase di ne tsa tlosiwa ka go di tlhotlhora. Morago ga moo se se fetang se ne sa tlhotlhorega ka 17,000 g metsotso e le 15 ka 4°C. Pellet e ne ya tlhongwa gape mo TNE mme saponin ya digitalis e ne ya okediwa go fitlha kwa kgobokanong ya bofelo ya 1%. Sekepe se ne sa tlhokomelwa ura e le 1 ka go dikologa ka 4°C, mme morago ga moo dikarolo tse di sa tlhotlhoregeng di ne tsa tlosiwa ka centrifugation ka 13,000 g ka 4°C metsotso e le 60. Bakeng sa ho hlophisa ha Gas1-GFP, pele ho hlahisa sampole ka dipheta tsa agarose tse se nang letho (ChromoTek) ho 4°C bakeng sa hora e le 1, mme ebe o hlahisa ka GFP-Trap_A (ChromoTek) ho 4°C bakeng sa dihora tse 3. Dipheta tse di nang le di-immunoblotting di ne tsa tlhatswiwa makgetlo a le matlhano ka TNE e e nang le 0.2% ya digoxigenin, tsa tlhatswiwa ka sethibela-sampole sa SDS, tsa kgaoganngwa mo SDS-PAGE, mme tsa sekasekwa ka immunoblotting.
Jaaka go tlhalositswe mo go (31), go ne ga dirwa tlhomamiso ya go golaganya sefapano mo karolwaneng e e humisitsweng ya ER. Ka bokhutshwane, karolwana e e humisitsweng ya ER e ne ya tlhokomelwa ka dithiobis ya 0.5 mM (propinate ya succinimidyl) (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA; 20 ° C, metsotso e le 20). Tsibogo ya go kopanya e ne ya timiwa ka go tsenya glycine (50 mM ya bofelo ya kgobokano, metsotso e le 5, 20°C).
Jaaka go tlhalositswe pelenyana (50), tshekatsheko ya MS ya ceramide mo mefuteng ya mofuta wa naga le ya GhLag1 e ne ya dirwa. Ka bokhutshwane, disele di ne tsa godisiwa go fitlha kwa legatong la eksponential (diyuniti di le 3 go ya go di le 4 tsa OD600/ml) mo YPD ka 30°C, mme disele di le 25×107 di ne tsa kotulwa. Phetogo ya dijo tsa bona e timiwa ka esiti ya tricchloroacetic. Dirisa setlhaolosi sa go ntsha [ethanolo, metsi, etere, piridine le 4.2 N ya amoniamo haeterokosaete (15:15:5:1:0.018 v/v)] le 1.2 nmol ya boleng jwa C17 e e tlwaelegileng ya ka fa gare (860517, Avanti polar lipid). Dirisa sediriswa sa monomethylamine [methanol, metsi, n-butanol le tharabololo ya methylamine (4:3:1:5 v/v)] go dira tlhaolo e e bonolo ya alkaline ya setlhotlhi, mme morago o dirise n-butanol e e tletseng metsi go ntsha letswai. Kwa bofelong, tlhotlholetso e ne ya tlhongwa gape mo setlhaolosing sa mokgwa o o siameng [tlelorofomo/methanolo/metsi (2:7:1) + 5 mM ya ammoniamo asetate] mme ya tsenngwa mo sepekterometareng sa bokete. Go ela tlhoko ditsibogo tse dintsi (MRM) go ne ga dirwa go supa le go lekanyetsa dimolekhule tsa sphingolipid. Setshwantsho sa bokete sa TSQ Vantage sa boraro sa quadrupole (Thermo Fisher Scientific) se tsentswe motswedi wa ione wa nanoflow wa roboto wa Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) go sekaseka mafura. The thulano matla e optimized bakeng sa mong le e mong ceramide sehlopha sa. MS ya data e ne e fumanwe ka mokgwa wa molemo. Bakeng sa poeletso e nngwe le e nngwe ya diphedi, letshwao la mafura ke bohareng ba ditekanyetso tse tharo tse ikemetseng.
Jaaka go tlhalositswe mo go (31), disele (800×107) tse di tlhagisang Gas1-GFP di ne tsa tsenngwa mo go tlhokeng go lwantsha malwetse ga tlholego. Gas1-GFP e e phepafaditsweng e ne ya kgaoganngwa ke SDS-PAGE mme ya fetisediwa kwa leraleng la polyvinylidene fluoride (PVDF). Porotheine e ne ya bonwa ka leitlho la mogopolo ka go tshasa PVDF ka amide e ntsho. Setlhopha sa Gas1-GFP se ne sa kgaolwa go tswa mo PVDF mme sa tlhatswiwa makgetlo a le 5 ka methanol le gangwe ka metsi a seedi sa chromatography-MS (LC-MS). Ka go tlhotlheletsa mothalo wa lera ka 500 μl ya 0.3 M NaOAc (pH 4.0), sethibela-metsi le 500 μl ya motswako wa sodiamo naetereiti ya 1 M e e sa tswang go tswakanngwa ka 37°C diura di le 3, karolwana ya mafura e gololwa go tswa mo Gas1-GFP le inophamine e e phatlaladitsweng fa gare ga go gololwa ga cerecosamine (51). Morago ga moo, mogala wa lera o ne wa tlhatswiwa makgetlo a le manè ka metsi a seemo sa LC-MS, wa omisiwa ka themperetšha ya phaposi, mme wa bolokwa mo lefaufaung la naeterojene ka -80°C go fitlha o sekasekwa. Jaaka taolo, sampole e e senang sepe ya lera la PVDF e ne ya dirisiwa mo tekong nngwe le nngwe. Lipid e e ntshitsweng mo Gas1-GFP e ne ya sekasekwa ke MS jaaka go tlhalositswe (50). Ka bokhutshwane, dithapo tsa PVDF tse di nang le GPI-lipid di ne tsa tlhongwa gape mo 75μl ya setlhaolosi sa mouta se se sa siamang [tlelorofomo / methanolo (1: 2) + 5 mM ya ammoniamo asetate] mme tsa feta ionization ya motlakase (ESI)-MRM / MS Tshekatsheko ya mefuta ya sphingolipid (TSQ Vantage). Tabeng ena, ya data MS e ne e fumanwe ka mokgwa wa Ion mpe.
Jaaka go umakilwe pelenyana, karolo ya mafura ya tshetledi ya GPI e ne ya kgaoganngwa le GPI-AP e e kwadilweng ka [3H]-inositol (16). Dilipidi di ne tsa kgaoganngwa ka go dirisa thulaganyo ya ditlhaolosi (55:45:10 tlelorofomo-methanol-0.25% KCl) mme tsa bonwa ka leitlho la mogopolo go dirisiwa FLA-7000 (Fujifilm).
Disele tse di tlhagisang Gas1-GFP (600 × 107) di ne tsa tlhatswiwa gabedi ka TNE buffer ka TNE buffer, mme tsa thubiwa ka dipheta tsa galase, mme morago ga moo tsa centrifuged go tlosa matlakala a disele le dipheta tsa galase. Morago ga moo se se neng se le mo godimo ga metsi se ne sa tlhotlhorega ka 17,000 g ura e le 1 ka 4°C. Pellet e ne ya tlhatswiwa mo TNE mme ya tlhokomelwa ka 1 U PI-PLC (Invitrogen) mo TNE e e nang le 0.2% ya saponin ya dijithale sebaka sa ura e le 1 kwa 37°C. Morago ga kalafi ya enzyme, lera le ne la tlosiwa ka go tlhotlhora ka 17,000 g ka 4°C sebaka sa ura e le 1. Go dira gore Gas1-GFP e nne le maatla a go lwantsha malwetse, se se neng se le mo godimo ga metsi se ne sa tlhokomelwa ka GFP-Trap_A (ChromoTek) ka 4°C bosigo jotlhe. Gas1-GFP e e phepafaditsweng e e kgaogantsweng ke SDS-PAGE e ne e tshwailwe ka botala jwa loapi jo bo phatsimang jwa Coomassie. Setlhopha sa go tshasa sa Gas1-GFP se ne sa kgaolwa go tswa mo mmala o o bosetlha o o dikologileng mosele wa metsi, mme morago ga go dira alkylation ka iodoacetamide le go fokotsa ka dithiothreitol, go ne ga dirwa tshilo ya dijo mo gel ka trypsin. Ntsha le go omisa dipeptide tsa tryptic le dipeptide tse di nang le GPI-glycans. Peptide e omisitsweng e ne e qhibidiha ka 20 μl ya metsi. Tlhaba karolo (8μl) mo LC. Kholomo ya octadecylsilane (ODS) (Develosil 300ODS-HG-5; molagare wa ka fa gare wa 150 mm×1.0 mm; Khemikhale ya Nomura, Kgaolo ya Aichi, Japane) e ne ya dirisiwa go kgaoganya dipeptide mo maemong a a rileng a motheo. Kgato e e tsamayang ke setlhaolosi A (0.08% ya esiti ya formiki) le setlhaolosi B (0.15% ya esiti ya formiki mo 80% ya asetonitrile). Thulaganyo ya Accela HPLC (Thermo Fisher Scientific, Boston, Massachusetts) e ne ya dirisiwa go ntsha kholomo ka setlhaolosi A mo metsotsong e le 55 ka seelo sa kelelo sa 50 μl mets-1 metsotso e le 5, mme morago ga moo kgobokano ya setlhaolosi B e ne ya okediwa go nna 40%. , Dinaga tsa Amerika). Eluate e ne e tswelela go tsenngwa mo motsweding wa ione wa ESI, mme dipeptide tsa tryptic le dipeptide tse di nang le GPI-glycans di ne tsa sekasekwa ke LTQ Orbitrap XL (sepekterometara sa bokete jwa serai sa ione sa mola o o kopantsweng; Thermo Fisher Saense). Mo thulaganyong ya MS, maatla a motswedi wa capillary a ne a bewa go 4.5 kV, mme themperetšha ya capillary ya phetiso e ne e beilwe kwa go 300°C. The capillary gagamalo le tube, lense gagamalo ba ne ba beha ho 15 V le 50 V, ka ho latellana. Tshedimosetso ya MS e ne ya bonwa ka mokgwa wa ion e e siameng (tharabololo ya 60,000; go nepagala ga bokete jwa dikarolo di le 10 ka milione) mo selekanyong sa bokete jwa 300/m/z bokete/tefiso (m/z) 3000. go thulana go go bakiwang ke go kgaogana (CID)].
Ditshwantshiso tsa MD di ne tsa dirwa ka go dirisa sofotewere ya GROMACS (52) le tšhemo ya maatla ya MARTINI 2 (53-55). Moagi wa Lera la CHARMM GUI (56, 57) o ne a dirisiwa go aga llaga e e nang le dioleoilfosfatidilkoline (DOPC) le Cer C18 kgotsa DOPC le Cer C26. Topology le ditekanyetso tsa Cer C26 di tswa mo DXCE ka go tlosa dipheta tse di oketsegileng mo mogatleng wa sphingosine. Dirisa thulaganyo e e tlhalosiwang fa tlase go lekalekanya llaga e e gabedi le go e tsamaisa, morago ga moo o dirise ditekanyetso tsa bofelo tsa thulaganyo go aga thulaganyo e e nang le Emp24. The transmembrane name ya tomoso Emp24 (masalla 173 ho 193) e ne e hahiloeng e le α-helix sebelisa pono MD (VMD) sesebediswa limolek'hule sebopeho (58). Go tswa foo, morago ga go tlosa di-lipid tse di neng di tshwaragane, poroteine ​​e ne ya dirwa dithoro tse di makgwakgwa mme ya tsenngwa mo bilayer go dirisiwa CHARMM GUI. Thulaganyo ya bofelo e na le di-DOPC di le 1202 le Di-Cer C26 di le 302 kgotsa di-DOPC di le 1197 le Di-Cer C18 le Emp24 di le 295. Ionize tsamaiso go fitlha go kgobokano ya 0.150M. Dipoeletso tse nne tse ikemetseng di ile tsa etswa bakeng sa ditlhamo tse pedi tsa bilayer.
The lipid bilayer e leka-lekanang ho sebedisa tshebetso ya CHARMM GUI, e kenyeletsang ho fokotsa le ho lekalekanya dikgato tse 405,000, moo dithibelo tsa boemo di fokotswang ka butle-butle le ho fediswa, mme kgato ya nako e eketswa ho tloha ho 0.005 ps ho isa ho 0.02 ps. Morago ga go lekalekanya, e ntsha 6 μs ka kgato ya nako ya 0.02 ps. Morago ga go tsenya Emp24, dirisa thulaganyo e e tshwanang ya CHARMM GUI go fokotsa le go lekalekanya tsamaiso, mme morago ga moo o tsamaye ka 8 s mo tlhagisong.
Bakeng sa dithulaganyo tsohle, nakong ya tshebetso ya ho lekalekanya, kgatello e laolwa ke barostate ya Berendsen (59), mme nakong ya tshebetso ya tlhahiso, kgatello e laolwa ke barostate ya Parrinello-Rahman (60). Mo mabakeng otlhe, kgatelelo ya palogare ke 1 bar mme go dirisiwa sekema sa go kopanya kgatelelo ya semi-isotropic. Mo thulaganyong ya go lekalekanya le go tlhagisa, go dirisiwa themosetate (61) e e nang le recalibration ya lebelo go kopanya themperetšha ya dikarolwana tsa poroteine, lipid le solvent ka go latelana. Nakong ya tshebetso kaofela, mocheso o lebisitsweng ke 310K. Tirisanommogo e e sa kgolaganeng e balelwa ka go tlhagisa lenaane la go kopanya go dirisiwa sekema sa Verlet se se nang le kgotlelelo ya buffer ya 0.005. Lereo la Coulomb le balelwa ka go dirisa lefelo la tsibogo le sekgala sa go kgaola sa 1.1 nm. Lereo la Vander Waals le dirisa sekema sa go kgaola se se nang le sekgala sa go kgaola sa 1.1 nm, mme sekema sa go kgaola sa Verlet se dirisiwa mo go kgoneng go kgeloga (62).
Ka go dirisa VMD, boleele jwa makhubu jo bo kgaotsweng fa gare ga dipheta tsa DOPC phosphate kgotsa dipheta tsa ceramide AM1 le poroteine ​​ke 0.7 nm, mme palo ya dilipidi tse di dirisanang le poroteine ​​e a balelwa. Go ya ka fomula e e latelang, bala ntlha ya go fokotsega-go humisa (DE) jaaka mo go (63): Ntlha ya DE = (palo ya dilipidi tsotlhe mo poroteineng 0.7) mo poroteineng 0.7 (palo ya Cer mo dipiding tsotlhe) .
Boleng bo tlalehilweng bo fumanwa e le palohare, mme dibara tsa phoso ke dikhopi tse nne tse ikemetseng tsa SE. Botlhokwa jwa dipalopalo jwa ntlha ya DE bo balelwa ka teko ya t [(palogare ya DE-ntlha-1)/SE]. Balela boleng jwa P go tswa mo kabo ya mogatla o le mongwe.
Sediriswa sa GROMACS se ne sa dirisiwa go bala mmapa wa kitlano ya matlhakore a 2D wa thulaganyo e e nang le Emp24 mo teng ga 250 ns ya bofelo ya motlhala. Gore go bonwe mmapa wa go humisa/go fokotsa wa ceramide, mmapa wa kitlano ya Cer o kgaoganngwa ka palo ya mmapa wa Cer le DOPC, mme morago ga moo o kgaoganngwe ka kgobokano ya Cer mo mmeleng. Go dirisiwa sekale sa mmapa wa mmala o o tshwanang.
Go bona didirisiwa tsa tlaleletso tsa setlhogo seno, tsweetswee leba http://advances.sciencemag.org/cgi/diteng.
Seno ke setlhogo se se bulegileng se se anamisiwang ka fa tlase ga melawana ya Laesense ya Creative Commons Attribution-Non-Commercial, e e letlang tiriso, go anamisiwa le go gatisiwa gape ka sedirisiwa sepe fela, fa fela tiriso ya bofelo e se ya go bona dipoelo tsa kgwebo mme ntlha e le gore tiro ya ntlha e nepagetse. Tshupetso.
Ela tlhoko: Re go kopa fela gore o neele aterese ya gago ya imeile gore motho yo o mo akantshang mo tsebeng a itse gore o batla gore a bone imeile le gore ga se sepamo. Ga re na go tsaya diaterese dipe tsa imeile.
Potso eno e dirisiwa go leka gore a o moeng le go thibela thomelo ya sepamo ka go itirisa.
Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez Logihope -Linero), Waga, Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
3D phahameng-qeto ea nako ea sebele ditshwantsho senola bohlokoa ba ceramide ketane bolelele bakeng sa protheine hlophisa ka khetha dipholo tsa libaka.
Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez Logihope -Linero), Waga, Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
3D phahameng-qeto ea nako ea sebele ditshwantsho senola bohlokoa ba ceramide ketane bolelele bakeng sa protheine hlophisa ka khetha dipholo tsa libaka.
©2020 Mokgatlho wa Amerika wa Kgatelopele ya Saense. ditshwanelo tsotlhe di beilwe. AAAS ke molekane wa HINARI, AGORA, OARE, KHORASE, CLOCKSS, CrossRef le COUNTER. Dikgatelopele tsa Saense ISSN 2375-2548.