Di-metabolite tse di fetolang masole a mmele ke karolo ya botlhokwa ya tikologo e nnye ya tlhagala (TME), mme kwa ntle ga di le mmalwa, boitshupo jwa tsone bo sa ntse bo sa itsiwe thata. Mona, re ile ra sekaseka dihlahala le disele tsa T ho tswa ho dihlahala le ascites tsa bakuli ba nang le kankere ya serous ya boemo bo phahameng (HGSC) ho senola metabolome ya dikarolo tsena tse fapaneng tsa TME. Ascites le disele tsa tlhagala di na le dipharologano tse dintsi tsa metabolite. Fa go bapisiwa le ascites, disele tsa T tse di tsenang mo tlhagala di humisitswe thata ka 1-methylnicotinamide (MNA). Le fa selekanyo sa MNA mo diseleng tsa T se tlhatlogile, go tlhagisiwa ga N-methyltransferase (ensaeme e e dirang gore ditlhopha tsa methyl di fetisiwe go tswa mo S-adenosylmethionine go ya kwa nikotinamide) go lekanyeditswe fela mo di-fibroblast le mo diseleng tsa tlhagala. Ka go dira, MNA e tlhotlheletsa disele tsa T go ntsha ntlha ya go bola ga tlhagala ya cytokine e e rotloetsang tlhagala ya alpha. Ka jalo, MNA e e tswang mo TME e thusa mo taolong ya masole a mmele a disele tsa T mme e emela setlhogo se se ka nnang teng sa kalafi ya masole a mmele sa kalafi ya kankere ya batho.
Di-metabolites tse di tswang mo ditlhaleng di ka nna le phelelo e e tseneletseng ya go thibela masole a mmele a a lwantshanang le ditlhagala, mme bosupi jo bontsi bo bontsha gore gape di ka nna selo se se botlhokwa se se dirang gore bolwetse bo tswelele pele (1). Mo godimo ga phelelo ya Warburg, tiro ya bosheng e simolotse go tlhaola boemo jwa metaboliki jwa disele tsa tlhagala le kamano ya jone le boemo jwa masole a mmele a tikologopotlana ya tlhagala (TME). Dithutopatlisiso mo dikaong tsa dipeba le disele tsa T tsa batho di bontshitse gore phetogo ya glutamine (2), phetogo ya oxidative (3) le phetogo ya glucose (4) di ka dira ka go ikemela mo ditlhotshwaneng tse di farologaneng tsa disele tsa masole a mmele. Di-metabolite di le mmalwa mo ditseleng tseno di thibela tiro ya disele tsa T e e kgatlhanong le ditlhagala. Go supilwe gore go thibelwa ga coenzyme tetrahydrobiopterin (BH4) go ka senya go ata ga disele tsa T, mme koketsego ya BH4 mo mmeleng e ka tokafatsa tsibogo ya masole a mmele a a kgatlhanong le ditlhagala e e tseregangwang ke CD4 le CD8. Mo godimo ga moo, phelelo ya go thibela masole a mmele ya kynurenine e ka pholosiwa ke go dirisa BH4 (5). Mo glioblastoma e e fetogang ya isocitrate dehydrogenase (IDH), go tswa ga enantiometabolic (R)-2-haeteroksiglutarate (R-2-HG) go thibela go dira ga disele tsa T, go ata le Tiro ya go tlhaola disele (6). Bosheng jaana, go bontshitswe gore methylglyoxal, e leng setlhagiswa sa glycolysis, e tlhagisiwa ke disele tse di gatelelang tsa tshimologo ya myeloid, mme phetiso ya disele tsa T ya methylglyoxal e ka thibela tiro ya disele tsa T tse di dirang. Ka kalafo, ho se nketse ha methylglyoxal ho ka hlola mosebetsi oa myeloid-e fumanwang disele tsa suppressor (MDSC) le synergistically ntlafatsa kalafo ya thibelo ya lefelo la ho hlahloba ka dikai tsa peba (7). Dithuto tseno mmogo di gatelela seabe sa botlhokwa sa di-metabolite tse di tswang mo TME mo go laoleng tiro le tiro ya disele tsa T.
Go sa dire sentle ga disele tsa T go begilwe thata mo kankereng ya mae (8). Seno ke ka ntlha ya dipharologantsho tsa metaboliki tse di tlholegileng mo go tlhokeng oksijene le mo methapong e e sa tlwaelegang ya tlhagala (9), e e felelang ka go fetolwa ga sukiri le tryptophan go nna ditlhagiswa tse di jaaka lactic acid le kynurenine. Lactate e e feteletseng ya kwa ntle ga sele e fokotsa tlhagiso ya interferon-γ (IFN-γ) mme e kgweetsa go farologana ga ditlhotshwana tsa myelosuppressive (10, 11). Tshebediso ya tryptophan e thibela ka kotloloho ho ata ha disele tsa T mme e thibela ho romelwa ha matshwao a moamohedi wa disele tsa T (12-14). Ho sa tsotellehe tlhokomelo tsena, mosebetsi o mongata o pota-potileng metabolism ya masole a mmele o ile wa etswa setsong sa mecha ya disele tsa T sa vitro ho sebediswa mecha ya ditaba e ntlafaditsweng, kapa e lekanyeditsweng ho dikai tsa dipeba tse tshwanang ka vivo, ha ho le e nngwe ya tsona e bontshang ka botlalo ho sa tshwane ha dikankere tsa batho le tikoloho ya Physiological macro le micro.
Ntlha e e tlwaelegileng ya kankere ya mae ke go anama ga peritoneal le go bonala ga ascites. Go kgobokana ga seedi sa disele mo ascites go amana le bolwetse jo bo tsweletseng le go sa bone sentle (15). Ho ya ka dipehelo, kamore ena e ikhethang e na le hypoxic, e na le maemo a phahameng a ntlha ya kgolo ya endothelial ya methapo (VEGF) le indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO), mme e kenella ke disele tsa taolo ya T le disele tse thibelang myeloid (15-18). Tikologo ya metaboliki ya ascites e ka nna ya farologana le ya tlhagala ka boyone, ka jalo go rulaganngwa sešwa ga disele tsa T mo sebakeng sa peritoneal ga go tlhaloganyesege sentle. Mo godimo ga moo, dipharologano tsa konokono le go sa tshwane fa gare ga ascites le di-metabolite tse di leng teng mo tikologong ya ditlhagala di ka nna tsa kgoreletsa go tsenelela ga disele tsa masole a mmele le tiro ya tsone mo ditlhaleng, mme go tlhokega dipatlisiso tse dingwe.
Gore re kgone go rarabolola mathata ano, re ne ra tlhama mokgwa wa go kgaoganya disele tse di bosisi le mokgwa wa go dirisa disele tsa tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) go ithuta mefuta e e farologaneng ya disele (go akaretsa le disele tsa CD4 + le CD8 + T) mmogo le mo teng le fa gare ga ditlhagala. Re sebedisa mokgwa ona mmoho le cytometry ya phallo ya boholo bo phahameng le tatelano ya RNA ya sele e le nngwe (scRNA-seq) ho fana ka setshwantsho se rarollotsweng haholo sa boemo ba metaboliki ba dihlopha tsena tsa bohlokwa. Mokgwa ono o ne wa senola koketsego e e bonalang ya selekanyo sa 1-methylnicotinamide (MNA) mo diseleng tsa T tsa tlhagala, mme diteko tsa mo vitro di ne tsa bontsha gore phelelo ya go fetola masole a mmele ya MNA mo tirong ya disele tsa T e ne e sa itsiwe pele. Ka kakaretso, mokgwa ona o senola ditshebedisano tsa metaboliki tse kopanetsweng pakeng tsa dihlahala le disele tsa masole a mmele, mme o fana ka kutlwisiso e ikgethileng ka di-metabolite tsa taolo ya masole a mmele, tse ka nnang tsa ba molemo bakeng sa kalafo ya kankere ya mae e thehilweng hodima disele tsa T immunotherapy Ditshono tsa kalafo.
Re dirisitse cytometry ya kelelo ya bogolo jo bo kwa godimo go lekanya ka nako e le nngwe go tsewa ga sukiri [2-(N-(7-nitrophenyl-2-oxa-1,3-diaza-4-yl)amino)-2-deoxyglucose (2-NBDG) le tiro ya mitochondrial [MitoTracker Deep Red, DR01] ditshwai tse di tlwaelegileng tse di farologanyang disele tsa masole a mmele le dipalopalo tsa disele tsa tlhagala (Lenaneo S2 le Setshwantsho S1A). Tshekatsheko eno e bontshitse gore fa e bapisiwa le disele tsa T, disele tsa ascites le tsa tlhagala di na le maemo a a kwa godimo a go tsaya sukiri, mme di na le dipharologano tse dinnye mo tirong ya mitochondrial. Palogare ya go tsewa ga sukiri ga disele tsa tlhagala [CD45-EpCAM (EpCAM)+] ke makgetlo a le mararo go ya go a le manè a disele tsa T, mme palogare ya go tsewa ga sukiri ga disele tsa CD4 + T ke makgetlo a le 1.2 a disele tsa CD8 + T, e leng se se bontshang gore di-lymphocyte tse di tsenang mo tlhagala di tlhoka TME tse di farologaneng). Go farologana le seo, tiro ya mitochondrial mo diseleng tsa tlhagala e tshwana le ya disele tsa CD4 + T, mme tiro ya mitochondrial ya mefuta ka bobedi ya disele e kwa godimo go feta ya disele tsa CD8 + T (Setshwantsho 1B). Ka kakaretso, dipholo tseno di senola selekanyo sa metaboliki. Tiro ya metaboliki ya disele tsa tlhagala e kwa godimo go feta ya disele tsa CD4 + T, mme tiro ya metaboliki ya disele tsa CD4 + T e kwa godimo go feta ya disele tsa CD8 + T. Ho sa tsotellehe ditlamorao tsena ho pholletsa le mefuta ya disele, ha ho na phapang e tsitsitseng boemong ba metaboliki ba disele tsa CD4 + le CD8 + T kapa ditekanyetso tsa tsona tse amanang le ascites ha di bapiswa le dihlahala (Setshwantsho 1C). Go farologana le seo, mo karolwaneng ya disele tsa CD45, karolo ya disele tsa EpCAM + mo tlhatsaneng e ne ya oketsega fa e bapisiwa le ascites (Setshwantsho 1D). Re boetse re lemohile phapang e hlakileng ya metaboliki pakeng tsa dikarolo tsa sele tsa EpCAM + le EpCAM-. Disele tsa EpCAM + (tlhagala) di na le go tsewa ga sukiri go go kwa godimo le tiro ya mitochondrial go feta disele tsa EpCAM-, e e kwa godimo thata go feta tiro ya metaboliki ya di-fibroblast mo diseleng tsa tlhagala mo TME (Setshwantsho 1, E le F).
(A le B) Bogare jwa go phatsima ga maatla (MFI) jwa go tsewa ga sukiri (2-NBDG) (A) le tiro ya mitochondrial ya disele tsa CD4 + T (MitoTracker e khibidu e e fifetseng) (B) Dikerafo tse di emelang (ka fa molemeng) le tshedimosetso e e kwadilweng mo lenaaneng (Ka fa mojeng), disele tsa CD8 + T le EpCAM + CD45-. (C) Tekanyo ya disele tsa CD4 + le CD8 + (tsa disele tsa CD3 + T) mo ascites le tlhagala. (D) Karolo ya EpCAM + disele tsa tlhagala mo ascites le tlhagala (CD45−). (E le F) EpCAM + CD45-tlhagala le EpCAM-CD45-matrikisi tsoekere go tsewa (2-NBDG) (E) le tiro ya mitochondrial (MitoTracker bohibidu jo bontsho) (F) dikerafo tse di emelang (ka fa molemeng) le tshedimosetso e e kwadilweng mo lenaaneng ( Ka fa mojeng) Ascites le disele tsa tlhagala. (G) Dikerafo tse di emelang tlhagiso ya CD25, CD137 le PD1 ka cytometry ya phallo. (H le I) CD25, CD137 le PD1 polelo mo diseleng tsa CD4 + T (H) le CD8 + T disele (I). (J le K) Diphenotaepe tse sa tsebeng letho, memoring ya bohareng (Tcm), memori ya sephetho (Teff) le memori ya sephetho (Tem) tse thehilweng hodima polelo ya CCR7 le CD45RO. Ditshwantsho tse di emelang (ka fa molemeng) le tshedimosetso ya tafole (ka fa mojeng) ya disele tsa CD4 + T (J) le disele tsa CD8 + T (K) mo di-ascites le mo ditlhaleng. Dipalopalo tsa P tse di tlhomamisiwang ke teko ya t e e kopantsweng (* P <0.05, ** P <0.01 le *** P <0.001). Mola o emela balwetse ba ba tshwanang (n = 6). FMO, go phatsima go ntsha nngwe; MFI, maatla a bogareng a fluorescence.
Tshekatsheko e nngwe e ne ya senola dipharologano tse dingwe tse di botlhokwa fa gare ga boemo jwa phenotypic ya sele ya T e e rarabolotsweng thata. The butswe (Setshwantsho 1, G ho I) le effector memoring ya (Setshwantsho 1, J le K) ka dihlahala ba haholo khafetsa ho feta ascites (karolo ya CD3 + T disele tse). Fela jalo, go sekaseka phenotype ka go tlhagisa ditshwai tsa go dira gore di dire (CD25 le CD137) le ditshwai tsa go fokotsega [poroteine ​​ya loso lwa sele e e rulagantsweng 1 (PD1)] go ne ga bontsha gore le fa dipharologantsho tsa metaboliki tsa dipalopalo tseno di farologane (Setshwantsho S1, B go ya go E) , Mme ga go na dipharologano tse di botlhokwa tsa metaboliki tse di neng tsa nna teng fa gare ga memory kgotsa S1. F go ya go I). Dipholo tseno di ne tsa netefadiwa ka go dirisa mekgwa ya go ithuta ka motšhini go abela diphenotaepe tsa disele ka go itirisa (21), e leng se se neng sa senola gape gore go na le palo e ntsi ya disele tsa moko wa marapo (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) mo ascites ya molwetse (Setshwantsho S2A ). Gareng ga mefuta yotlhe ya disele e e supilweng, palo eno ya disele tsa myeloid e bontshitse go tsewa ga sukiri go go kwa godimo le tiro ya mitochondrial (Setshwantsho S2, B go ya go G). Dipholo tseno di tlhagisa dipharologano tse di maatla tsa metaboliki magareng ga mefuta e mentsi ya disele tse di fitlhelwang mo di-ascites le mo ditlhaleng mo balwetseng ba HGSC.
Kgwetlho e kgolo mo go tlhaloganyeng dipharologantsho tsa metabonomic tsa TIL ke tlhokego ya go kgaoganya disampole tsa disele tsa T tsa bophepa jo bo lekaneng, boleng le bontsi go tswa mo ditlhaleng. Dithuto tsa bošeng di bontshitse gore mekgwa ya go tlhopha le go humisa dipheta e e ikaegileng ka cytometry ya kelelo e ka baka diphetogo mo diporofaeleng tsa metabolite ya disele (22-24). Go fenya bothata jono, re ne ra tokafatsa mokgwa wa go humisa dipheta go kgaoganya le go kgaoganya TIL mo kankereng ya mae a motho e e kgaotsweng ka karo pele ga tshekatsheko ka LC-MS / MS (bona Didirisiwa le Mekgwa; Setshwantsho 2A). Gore re kgone go sekaseka tshusumetso ka kakaretso ya porothokholo eno mo diphetogong tsa metabolite, re ne ra bapisa diporofaele tsa metabolite tsa disele tsa T tse di dirilweng ke baabi ba ba itekanetseng morago ga kgato e e fa godimo ya go kgaoganya dipheta le disele tse di neng di sa kgaoganngwa ka dipheta mme di ne di ntse di le mo aeseng. Tshekatsheko eno ya taolo ya boleng e fitlhetse gore go na le kamano e e kwa godimo fa gare ga maemo a mabedi ano (r = 0.77), mme go boelediwa ga setegeniki ga setlhopha sa dimetabolite di le 86 go na le go boelediwa go go kwa godimo (Setshwantsho 2B). Ka jalo, mekgwa eno e ka dira tshekatsheko e e nepagetseng ya metabolite mo diseleng tse di dirang mofuta wa disele, ka jalo e tlamela ka sethala sa ntlha sa resolution e e kwa godimo sa go supa di-metabolite tse di rileng mo HGSC, ka jalo e dira gore batho ba kgone go tlhaloganya ka tsela e e tseneletseng go tlhaloganyesega ga disele tse di rileng Lenaneo la metabolism ya thobalano.
(A) Setshwantsho sa sekema sa go humisa dipheta tsa makenete. Pele ga tshekatsheko ka LC-MS/MS, disele di tla feta mo ditikologong tse tharo tse di latelanang tsa go humisiwa ka dipheta tsa makenete kgotsa di tla nna mo aeseng. (B) Phello ya mofuta wa ho ruisa ka bongata ba di-metabolite. Palogare ya ditekanyo tse tharo tsa mofuta mongwe le mongwe wa go humisa ± SE. Mola o motala o emela kamano ya 1:1. Kamano ya ka hare-sehlopha (ICC) ya ditekanyetso tse pheta-phetang tse bontshitsweng leiboleng ya aseke. NAD, e leng nikotinamaete ya adenine. (C) Setshwantsho sa sekema sa kelelo ya tiro ya tshekatsheko ya metabolite ya molwetse. Di-ascites kgotsa ditlhagala di kokoanngwa mo balwetseng mme di bolokwa mo serame. Karolo e nnye ya sampole nngwe le nngwe e ne ya sekasekwa ka flow cytometry, fa disampole tse di setseng di ne tsa dira ditikologo di le tharo tsa go humisa disele tsa CD4+, CD8+ le CD45-. Dikarolwana tseno tsa disele di ne tsa sekasekwa go dirisiwa LC-MS/MS. (D) Mmapa wa mogote wa bontsi jwa metabolite e e tlhomamisitsweng. Dendrogram e emela go kgobokanya ga Ward ga dikgala tsa Euclidean magareng ga disampole. (E) Tshekatsheko ya karolo e kgolo (PCA) ya mmapa wa metabolite wa sampole, e e bontshang dipoeletso tse tharo tsa sampole nngwe le nngwe, disampole tse di tswang mo molwetseng a le mongwe di golaganngwa ka mola. (F) PCA ya porofaele ya metabolite ya sampole e e beilweng mo molwetseng (ke gore, go dirisa go tlhoka tiro ka bontlhabongwe); mofuta wa sampole o lekanyeditswe ke lebopo le le tshophodi. PC1, karolo e kgolo 1; PC2, karolo e kgolo ya 2.
Morago ga moo, re ne ra dirisa mokgwa ono wa go humisa go sekaseka di-metabolite di le 99 mo dikarolwaneng tsa disele tsa CD4 +, CD8 + le CD45 mo di-ascites tsa konokono le ditlhagala tsa balwetse ba le barataro ba HGSC (Setshwantsho 2C, Setshwantsho S3A le Lenaneo S3 le S4). Batho ba ba kgatlhegelwang ba dira 2% go ya go 70% ya sampole e kgolo ya ntlha ya disele tse di tshelang, mme karolo ya disele e farologana thata fa gare ga balwetse. Morago ga go kgaoganya dipheta, karolwana e e humisitsweng ya kgatlhego (CD4+, CD8+ kgotsa CD45-) e dira go feta 85% ya disele tsotlhe tse di tshelang mo sampoleng ka palogare. Mokgwa ono wa go humisa o re letla go sekaseka dipalopalo tsa disele go tswa mo metabolism ya dithishu tsa tlhagala ya batho, e leng se se sa kgonegeng go se dira go tswa mo disampole tse dikgolo. Ho sebedisa prothokholo ena, re ile ra etsa qeto ya hore l-kynurenine le adenosine, tsena tse pedi tse nang le dipharologantsho tse ntle tsa ho thibela masole a mmele di ne di phahamisitswe disele tsa T tsa hlahala kapa disele tsa hlahala (Setshwantsho S3, B le C). Ka jalo, dipholo tseno di bontsha boikanyegi le bokgoni jwa thekenoloji ya rona ya go kgaoganya disele le mass spectrometry go bona di-metabolite tse di botlhokwa mo ditsheding mo dithishung tsa molwetse.
Tshekatsheko ya rona gape e senotse karogano e e maatla ya metaboliki ya mefuta ya disele mo teng le fa gare ga balwetse (Setshwantsho 2D le Setshwantsho S4A). Ka ho khetheha, ha ho bapisoa le bakuli ba bang, mokuli 70 o bontshitse dipharologantsho tse fapaneng tsa metaboliki (Setshwantsho sa 2E le Setshwantsho sa S4B), se bontshang hore ho ka nna ha ba le ho sa tshwane ho hoholo ha metaboliki pakeng tsa bakuli. Go botlhokwa go ela tlhoko gore fa go bapisiwa le balwetse ba bangwe (dilitara di le 1.2 go ya go di le 2; Lenaneo S1), palogotlhe ya ascites e e kokoantsweng mo molwetseng wa 70 (80 ml) e ne e le nnye. Taolo ya heterogeneity ya balwetse ba ba fa gare ka nako ya tshekatsheko ya karolo e kgolo (ka sekai, go dirisa tshekatsheko ya redundancy e e sa felelang) e bontsha diphetogo tse di tlhomameng fa gare ga mefuta ya disele, mme mefuta ya disele le/kgotsa tikologopotlana di kopantswe ka tlhamalalo go ya ka porofaele ya metabolite (Setshwantsho 2F ). Tshekatsheko ya di-metabolite tse di nosi e ne ya gatelela ditlamorago tseno mme ya senola dipharologano tse dikgolo fa gare ga mefuta ya disele le tikologo e nnye. Go botlhokwa go ela tlhoko gore pharologano e e feteletseng thata e e lemogilweng ke MNA, e gantsi e humisitsweng ka disele tsa CD45- le ka disele tsa CD4+ le CD8+ tse di tsenelelang mo tlhatsaneng (Setshwantsho 3A). Mo diseleng tsa CD4 +, phelelo eno e bonala sentle thata, mme MNA mo diseleng tsa CD8 + le yone e lebega e amiwa thata ke tikologo. Le fa go ntse jalo, seno ga se botlhokwa, ka gonne ke balwetse ba le bararo fela mo go ba le barataro ba ba ka sekasekiwang go bona maduo a CD8+ a tlhagala. Mo godimo ga MNA, mo mefuteng e e farologaneng ya disele mo ascites le mo ditlhaleng, di-metabolites tse dingwe tse di sa tlhaolwang sentle mo TIL le tsone di humile ka go farologana (Ditshwantsho S3 le S4). Ka jalo, tshedimosetso eno e senola sete e e solofetsang ya di-metabolite tse di fetolang masole a mmele gore go dirwe dipatlisiso tse dingwe.
(A) Diteng tse di tlwaelegileng tsa MNA mo diseleng tsa CD4 +, CD8 + le CD45- go tswa mo ascites le tlhagala. Poloto ya lebokoso e bontsha bogareng (mola), selekanyo sa magareng ga dikwatara (segogo sa foreimi) le selekanyo sa tshedimosetso, go fitlha go makgetlo a le 1.5 a selekanyo sa magareng ga dikwatara (ditedu tsa foreimi). Jaaka go tlhalositswe mo Didirisiweng tsa Molwetse le Mekgwa, dirisa boleng jwa limma jwa molwetse go bona boleng jwa P (*P<0.05 le **P<0.01). (B) Setshwantsho sa sekema sa phetoho ya MNA (60). Dijo tse di fetogang: S-adenosil-1-methionine; SAH, S-adenosine-1-homosisteine; NA, nikotinamide; MNA, 1-methelenikotinamide; 2-PY, 1-methaele- 2-piridone-5-khaboksamaete; 4-PY, 1-methaele-4-piridone-5-khaboksamaete; NR, ribose ya nikotinamide; NMN, e leng nyukleotaete ya nikotinamaete. Diensaeme (tala): NNMT, nikotinamide N-methylphetiso; SIRT, di-sirtune; NAMPT, e leng sediriswa sa go fetisa fosforibosile sa nikotinamide; AOX1, aldehaete oksaetese 1; NRK, kinase ya ribosaete ya nikotinamide; NMNAT, nikotinamaete e le nngwe ya nyukleotaete ya phetisetso ya adenilate; Pnp1, fosforalaise ya nyukleosaete ya purine. (C) t-SNE ya scRNA-seq ya ascites (boputswa) le tlhagala (bohibidu; n = 3 balwetse). (D) NNMT polelo mo ditlhopheng tse di farologaneng tsa disele tse di supilweng go dirisiwa scRNA-seq. (E) Polelo ya NNMT le AOX1 mo SK-OV-3, diphilo tsa motho tsa lesea (HEK) 293T, disele tsa T le disele tsa T tse di alafilweng ka MNA. Polelo e e menaganeng e bontshiwa mabapi le SK-OV-3. Mokgwa wa polelo le SEM o bontshitswe (n = 6 bafani ba phetseng hantle). Dipalopalo tsa Ct tse di fetang 35 di tsewa di sa lemotshege (UD). (F) Polelo ya SLC22A1 le SLC22A2 mo SK-OV-3, HEK293T, disele tsa T le disele tsa T tse di alafilweng ka MNA ya 8mM. Polelo e e menaganeng e bontshiwa mabapi le SK-OV-3. Mokgwa wa polelo le SEM o bontshitswe (n = 6 bafani ba phetseng hantle). Dipalopalo tsa Ct tse di fetang 35 di tsewa di sa lemotshege (UD). (G) Diteng tsa MNA tsa sele mo diseleng tsa T tse di itekanetseng tse di dirilweng morago ga diura di le 72 tsa go tlhoga le MNA. Mokgwa wa polelo le SEM o bontshitswe (n = 4 bafani ba phetseng hantle).
MNA e tlhagisiwa ka go fetisa setlhopha sa methyl go tswa go S-adenosyl-1-methionine (SAM) go ya kwa nikotinamiding (NA) ka nikotinamide N-methyltransferase (NNMT; Setshwantsho 3B). NNMT e tlhagisitswe go feta selekanyo mo mefuteng e e farologaneng ya dikankere tsa batho mme e amana le go ata, go tlhasela le go anama (25-27). Go tlhaloganya botoka motswedi wa MNA mo diseleng tsa T mo TME, re ne ra dirisa scRNA-seq go tlhaola polelo ya NNMT go ralala mefuta ya disele mo ascites le ditlhagala tsa balwetse ba bararo ba HGSC (Table S5). Tshekatsheko ya disele di ka nna 6 500 e bontshitse gore mo ditikologong tsa ascites le tsa tlhagala, go tlhagisiwa ga NNMT go ne go lekanyeditswe go dipalopalo tsa disele tsa fibroblast le tsa tlhagala tse di akanngwang (Setshwantsho 3, C le D). Go botlhokwa go ela tlhoko gore ga go na tlhagiso e e bonalang ya NNMT mo palong epe e e tlhagisang PTPRC (CD45 +) (Setshwantsho 3D le Setshwantsho S5A), se se supang gore MNA e e lemogilweng mo sebopegong sa metabolite e tsentswe mo diseleng tsa T. Polelo ya aldehyde oxidase 1 (AOX1) e fetola MNA go nna 1-methyl-2-piridone-5-khaboksamide (2-PYR) kgotsa 1-methyl-4-piridone-5-khaboksamide (4- PYR); Setshwantsho sa 3B) gape se lekanyeditswe go palo ya di-fibroblast tse di tlhagisang COL1A1 (Setshwantsho sa S5A), tse mmogo di supang gore disele tsa T di tlhoka bokgoni jwa go fetola dijo tse di tlwaelegileng tsa MNA. The poleloana e reng paterone tsena MNA-amanang dijini e ne e netefaditswe ho sebelisa bobeli ikemetseng sele ya data sete ho tloha ascites ho tloha HGSC bakuli (Setshwantsho S5B; n = 6) (16). Ho phaella moo, tshekatsheko ya karabelo ya ketane ya polymerase (qPCR) ya disele tsa T tse phetseng hantle tsa monehedi tse alafilweng ka MNA e bontshitse hore ha e bapiswa le disele tsa tlhahala ya SK-OV-3 ya taolo, NNMT kapa AOX1 e ne e batla e sa hlahiswa (Setshwantsho 3E). Dipholo tseno tse di sa lebelelwang di bontsha gore MNA e ka nna ya tswa mo di-fibroblast kgotsa mo ditlhaleng go tsena mo diseleng tsa T tse di bapileng mo TME.
Le fa bontlhopheng ba akaretsa lelapa la ditshodi tsa di-cation tsa ditshedi 1 go ya go 3 (OCT1, OCT2 le OCT3) tse di tsenngwang khoutu ke lelapa la ditshodi tse di tlhotlhoregang 22 (SLC22) (SLC22A1, SLC22A2 le SLC22A3), ditshodi tse di ka nnang teng tsa MNA di sa ntse di sa tlhalosiwe (28) . QPCR ya mRNA ho tswa ho disele tsa T tse phetseng hantle tsa monehedi e bontshitse maemo a tlase a polelo ya SLC22A1 empa maemo a sa lemoheng a SLC22A2, e ileng ya netefatsa hore e ne e behilwe pele dingolweng (Setshwantsho 3F) (29). Ho fapana le hoo, SK-OV-3 ovarian hlahala sele mola bontshiweng maemo a phahameng a bobeli transporters (Setshwantsho 3F).
Gore go lekiwe kgonagalo ya gore disele tsa T di nne le bokgoni jwa go monya MNA ya kwa ntle, disele tsa T tse di itekanetseng tsa moneela di ne tsa tlholwa diura di le 72 go na le dilekanyo tse di farologaneng tsa MNA. Fa go sena MNA ya exogenous, diteng tsa sele tsa MNA ga di ka ke tsa lemogiwa (Setshwantsho 3G). Le fa go ntse jalo, disele tsa T tse di dirilweng tse di alafilweng ka MNA ya exogenous di bontshitse koketsego e e ikaegileng ka selekanyo sa diteng tsa MNA mo diseleng, go fitlha go 6 mM MNA (Setshwantsho 3G). Sephetho sena se bontsha hore ho sa tsotellehe boemo bo tlase ba tlhaloso ya transporter le ho hloka enzyme e ka sehloohong e ikarabellang bakeng sa metabolism ya MNA e kahare ho disele, TIL e ntse e ka nka MNA.
Sebopeho sa di-metabolites diseleng tsa T tsa bakudi le diteko tsa ho monya MNA tsa in vitro di eketsa kgonahalo ya hore di-fibroblast tse amanang le kankere (CAF) di ntshe MNA mme disele tsa hlahala di ka laola phenotype le tshebetso ya TIL. Go bona gore MNA e ama jang diseleng tsa T, disele tsa T tse di itekanetseng tsa moneelo di ne tsa dirisiwa mo vitro fa MNA e le teng kgotsa e seyo, mme go ne ga sekasekiwa go ata ga tsone le go tlhagisiwa ga di-cytokine. Morago ga malatsi a le 7 a go oketsa MNA ka selekanyo se se kwa godimo, palo ya go menagana gabedi ya baagi e ne ya fokodiwa ka selekanyo se se magareng, fa maatla a ne a bolokwa mo ditekanyong tsotlhe (Setshwantsho 4A). Mo godimo ga moo, kalafi ya MNA e e tswang kwa ntle e ne ya felela ka gore go nne le koketsego ya selekanyo sa disele tsa CD4 + le CD8 + T tse di tlhagisang ntlha ya go bola ga tlhagala-α (TNFα; Setshwantsho 4B). Go farologana le seo, tlhagiso ya IFN-γ mo teng ga disele e ne ya fokodiwa thata mo diseleng tsa CD4 + T, mme e seng mo diseleng tsa CD8 + T, mme go ne go se na phetogo e e bonalang mo interleukin 2 (IL-2; Setshwantsho 4, C le D). Ka jalo, tlhatlhobo ya immunosorbent e e golagantsweng le enzyme (ELISA) ya di-supernatant go tswa mo ditso tseno tsa disele tsa T tse di alafilweng ka MNA e ne ya bontsha koketsego e e bonalang ya TNFα, phokotsego ya IFN-γ, le go tlhoka phetogo mo IL-2 (Setshwantsho 4, E go ya go G). . Go fokotsega ga IFN-γ go bontsha gore MNA e ka nna le seabe mo go thibeleng tiro ya disele tsa T tse di lwantshang ditlhagala. Gore go etsisiwe phelelo ya MNA mo go botlholeng jwa disele tse di tseregangwang ke disele tsa T, disele tsa moamogedi wa antigen wa chimeric T (FRα-CAR-T) tse di lebileng moamogedi wa folate α le CAR-T (GFP) tse di laolwang ke disele tsa poroteine ​​e e tala ya fluorescent (GFP) -CAR-T) di tlhagisiwa ke disele tse di itekanetseng tsa moneelo wa madi a a kwa ntle ( mononunuPBMC). Disele tsa CAR-T di ne tsa tlholwa diura di le 24 go na le MNA, mme morago ga moo tsa tlholwa mmogo le disele tsa tlhagala ya mae tsa SK-OV-3 tse di tlhagisang moamogedi wa folate α ka selekanyo sa 10:1. Kalafo ya MNA e ne ya felela ka phokotsego e e bonalang ya tiro ya go bolaya ya disele tsa FRα-CAR-T, e e neng e tshwana le disele tsa FRα-CAR-T tse di neng di alafiwa ka adenosine (Setshwantsho 4H).
(A) Palogotlhe ya disele tse di kgonang go dira le go menagana gabedi ga baagi (PD) ka tlhamalalo go tswa mo setsong ka letsatsi la 7. Kerafo ya bara e emela palogare + SEM ya baabi ba le barataro ba ba itekanetseng. E emela tshedimosetso go tswa mo ditekong tse di ikemetseng tsa bonnye n = 3. (B go ya go D) CD3/CD28 le IL-2 di ne tsa dirisiwa go dira gore disele tsa T di dire ka selekanyo sa tsone sa MNA ka malatsi a le 7. Pele ga tshekatsheko, disele di ne tsa tlhotlhelediwa ka PMA/ionomycin ka GolgiStop diura di le 4. TNFα (B) polelo mo diseleng tsa T. Sekao sa setshwantsho (ka fa molemeng) le tshedimosetso ya tafole (ka fa mojeng) ya tlhagiso ya TNFα mo diseleng tse di tshelang. IFN-γ (C) le IL-2 (D) polelo mo diseleng tsa T. Polelo ea di-cytokine e ne e lekanngwa ka cytometry ya phallo. Kerafo ya bara e emela palogare (n = 6 ya baabi ba ba itekanetseng) + SEM. Dirisa tshekatsheko ya tsela e le nngwe ya pharologano le dikgato tse di boaboelediwang (*P<0.05 le **P<0.01) go bona boleng jwa P. E emela tshedimosetso go tswa mo ditekong tse di ikemetseng tsa bonnye n = 3. (E go ya go G) CD3/CD28 le IL-2 di ne tsa dirisiwa go dira gore disele tsa T di dire ka selekanyo sa tsone sa MNA ka malatsi a le 7. Sediriswa se ne sa kokoanngwa pele le morago ga diura di le 4 tsa go tlhotlhelediwa ga PMA/ionomycin. Ditekanyo tsa TNFα (E), IFN-γ (F) le IL-2 (G) di ne tsa lekanngwa ka ELISA. Kerafo ya bara e emela palogare (n = 5 baabi ba ba itekanetseng) + SEM. Boleng ba P bo tlhomamisitsweng ka go dirisa tshekatsheko ya tsela e le nngwe ya pharologano le ditekanyo tse di boaboelediwang (* P <0.05). Mola o o marontho o supa tekanyetso ya go lemogwa ga go lemogwa. (H) Teko ya lysis ya disele. Disele tsa FRα-CAR-T kgotsa GFP-CAR-T di ne tsa fetolwa ka adenosine (250μM) kgotsa MNA (10 mM) diura di le 24, kgotsa tsa tlogelwa di sa alafiwa (Ctrl). Peresente ya polao ya disele tsa SK-OV-3 e ne ya lekanngwa. Boleng jwa P bo laolwa ke teko ya Welch t (* P <0.5 le ** P <0.01).
E le hore ho fumana kutlwisiso ya mechanistic ya MNA-itšetlehileng ka TNFα poleloana e reng molawana, diphetoho ka TNFα mRNA ya MNA-tšoaroa T lisele tse ile tsa hlahloba (Setshwantsho 5A). Disele tsa T tse di itekanetseng tsa moneelo tse di alafilweng ka MNA di bontshitse koketsego e e menaganeng gabedi mo maemong a go kwalololwa ga TNFα, se se supang gore MNA e ikaegile ka taolo ya go kwalololwa ga TNFα. Ho batlisisa ena kgonego taolo mokgwa wa, tse peli tsebahalang phetolelo mabaka a laolang TNFα, e leng butswe T sele nyutlelie ntlha (NFAT) le protheine e itseng 1 (Sp1), ba ile ba hlahloba ho arabela MNA tlamang ho proximal TNFα moetapele ( 30). Motlhotlheletsi wa TNFα o na le mafelo a le 6 a a supilweng a go tlama a NFAT le mafelo a le 2 a a tlamang a Sp1, a a kopanang mo lefelong le le lengwe [-55 dipara tsa motheo (bp) go tswa mo 5'cap] (30). Chromatin immunoprecipitation (ChIP) e bontshitse gore fa e ne e alafiwa ka MNA, go tshwaragana ga Sp1 le motlhotlheletsi wa TNFα go ne ga oketsega makgetlo a le mararo. Go tsenngwa ga NFAT le gone go ne ga oketsega le go atamela botlhokwa (Setshwantsho 5B). Dintlha tseno di bontsha gore MNA e laola go tlhagisiwa ga TNFα ka go kwalololwa ga Sp1, mme ka selekanyo se sennye go tlhagisiwa ga NFAT.
(A) Fa go bapisiwa le disele tsa T tse di tlhomilweng kwantle ga MNA, phetogo ya menagano ya polelo ya TNFα mo diseleng tsa T tse di alafilweng ka MNA. Mokgwa wa polelo le SEM o bontshitswe (n = 5 bafani ba phetseng hantle). E emela tshedimosetso go tswa mo ditekong tse di ikemetseng tsa bonnye n = 3. (B) The TNFα moetapele wa disele tsa T tšoaroa le kapa ntle le 8 mM MNA ka mor'a NFAT le Sp1 ba ne ba kopantswe le (Ctrl) le PMA / ionomycin tlhotlheletso bakeng sa lihora tse 4. Immunoglobulin G (IgG) le H3 di ne di dirisiwa jaaka ditaolo tse di sa siamang le tse di siameng tsa go tlhotlhora ga masole a mmele, ka go latelana. Go lekanyetsa ga ChIP go bontshitse gore go tlama ga Sp1 le NFAT mo motlhotlheletsi wa TNFα mo diseleng tse di alafilweng ka MNA go ne ga oketsega makgetlo a le mmalwa fa go bapisiwa le taolo. E emela tshedimosetso go tswa mo ditekong tse di ikemetseng tsa bonnye n = 3. Boleng ba P bo laolwang ke diteko tsa t tse ngata (*** P <0.01). (C) Fa go bapisiwa le ascites ya HGSC, disele tsa T (tse e seng tsa cytotoxic) di bontshitse go tlhagisiwa go go oketsegileng ga TNF mo tlhatsaneng. Mebala e emela balwetse ba ba farologaneng. Disele tse di bontshitsweng di tserwe disampole ka go sa rulaganngwa go fitlha go 300 mme tsa tlhotlhorega go fokotsa go thala go feta selekanyo (** Padj = 0.0076). (D) Mofuta o o tshitshintsweng wa MNA wa kankere ya mae. MNA e tlhagisiwa mo diseleng tsa tlhagala le di-fibroblast mo TME mme e tsewa ke disele tsa T. MNA e oketsa go tlama ga Sp1 le motlhotlheletsi wa TNFα, mme seno se dira gore go nne le go kwalololwa ga TNFα go go oketsegileng le go tlhagisiwa ga di-cytokine tsa TNFα. MNA gape e dira gore IFN-γ e fokotsege. Go thibela tiro ya disele tsa T go dira gore bokgoni jwa go bolaya bo fokotsege le go gola ga tlhagala ka bonako.
Ho ya ka dipehelo, TNFα e na le ditlamorao tse itshetlehileng ka pele le morao tsa ho lwantsha sehlahala le ho lwantsha sehlahala, empa e na le seabo se tsebahalang ho kgothaletsa kgolo le metastasis ya kankere ya mae (31-33). Ho ya ka dipehelo, mahloriso a TNFα ka ascites le dinama tse nyenyane tse hlahala ka bakuli ba nang le kankere ovarian e phahameng ho feta hore ka dinama tse nyenyane tse benign (34-36). Mabapi le mokgwa wa tshebetso, TNFα e ka laola ho kengwa tshebetsong, tshebetso le ho ata ha disele tse tshweu tsa madi, le ho fetola phenotype ya disele tsa kankere (37, 38). Go dumalana le diphitlhelelo tseno, tshekatsheko ya go tlhagisa dijini tse di farologaneng e ne ya bontsha gore TNF e ne e laolwa thata mo diseleng tsa T mo dithishung tsa tlhagala fa e bapisiwa le ascites (Setshwantsho 5C). Koketsego ya polelo ya TNF e ne e bonala fela mo ditlhopheng tsa disele tsa T tse di nang le phenotype e e seng ya cytotoxic (Setshwantsho S5A). Ka bokhutshwane, tshedimosetso eno e tshegetsa pono ya gore MNA e na le ditlamorago tse pedi tsa go thibela masole a mmele le go rotloetsa tlhagala mo HGSC.
Go tshwaya ga fluorescent go go ikaegileng ka cytometry ya kelelo e nnile mokgwa o mogolo wa go ithuta phetogo ya dijo tsa TIL. Dithutopatlisiso tseno di bontshitse gore fa di bapisiwa le di-lymphocyte tsa madi a a kwa ntle kgotsa disele tsa T go tswa mo dirweng tsa lymphoid tsa bobedi, TIL ya murine le ya batho e na le tshekamelo e e kwa godimo ya go tsaya sukiri (4, 39) le go latlhegelwa ke tiro ya mitochondrial ka iketlo (19, 40). Le fa re lemogile dipholo tse di tshwanang mo thutong eno, ntshetsopele ya konokono ke go bapisa metabolism ya disele tsa tlhagala le TIL go tswa mo thishung e e tshwanang ya tlhagala e e kgaotsweng. Go dumalana le dingwe tsa dipegelo tseno tse di fetileng, disele tsa tlhagala (CD45-EpCAM +) go tswa mo ascites le ditlhagala di na le go tsewa ga sukiri go go kwa godimo go feta disele tsa CD8 + le CD4 + T, go tshegetsa gore go tsewa ga sukiri go go kwa godimo ga disele tsa tlhagala go ka bapisiwa le disele tsa T. Kgopolo ya kgaisano ya disele tsa T. TME. Le fa go ntse jalo, tiro ya mitochondrial ya disele tsa tlhagala e kwa godimo go feta ya disele tsa CD8 + T, mme tiro ya mitochondrial e tshwana le ya disele tsa CD4 + T. Dipholo tseno di tiisa setlhogo se se tlhagelelang sa gore metabolism ya oxidative e botlhokwa mo diseleng tsa tlhagala (41, 42). Ba akantsha gape gore disele tsa CD8 + T di ka nna tsa tlhaselwa ke go sa dire sentle ga oksijene go feta disele tsa CD4 + T, kgotsa gore disele tsa CD4 + T di ka nna tsa dirisa metswedi ya khabone kwa ntle ga sukiri go boloka tiro ya mitochondrial (43, 44). Go tshwanetse ga elwa tlhoko gore ga re a lemoga pharologano epe mo go tseyeng sukiri kgotsa tiro ya mitochondrial fa gare ga di-effector tsa CD4 + T, memori wa di-effector tsa T le disele tsa memori wa bogareng jwa T mo ascites. Fela jalo, boemo jwa pharologano jwa disele tsa CD8 + T mo ditlhaleng ga bo amane ka gope le diphetogo tsa go tsewa ga sukiri, go totobatsa pharologano e e botlhokwa fa gare ga disele tsa T tse di tlhomilweng mo vitro le TIL ya batho mo vivo (22). Ditemogo tseno di ne tsa netefadiwa gape ke tiriso ya kabo ya palo ya disele e e sa tseyeng letlhakore, e e neng ya senola gape gore disele tsa CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + tse di nang le go tsewa ga sukiri e e kwa godimo le tiro ya mitochondrial go feta disele tsa tlhagala di aname mme di na le palo ya disele tse di dirang tsa Metabolic. Batho bano ba ka nna ba emela setlhotshwana se se akanngwang sa disele tse di gatelelang myeloid kgotsa disele tsa plasmacytoid dendritic tse di supilweng mo tshekatshekong ya scRNA-seq. Le fa tseno ka bobedi di begilwe mo ditlhaleng tsa mae a batho [45], di sa ntse di tlhoka Tiro e nngwe ke go tlhalosa setlhotshwana seno sa myeloid.
Le fa mekgwa e e theilweng mo flow cytometry e ka tlhalosa dipharologano ka kakaretso tsa sukiri le phetogo ya oksijene fa gare ga mefuta ya disele, dimetabolite tse di tlhomameng tse di tlhagisiwang ke sukiri kgotsa metswedi e mengwe ya khabone ya phetogo ya mitochondrial mo TME ga di ise di tlhomamisege. Go abela go nna teng kgotsa go tlhokafala ga di-metabolites mo setlhopheng se sennye sa TIL se se rileng go tlhoka go phepafadiwa ga palo ya disele go tswa mo thishung e e kgaotsweng. Ka jalo, mokgwa wa rona wa go humisa disele o o kopantsweng le spectrometry ya bontsi o ka naya dintlha ka ga di-metabolite tse di humisitsweng ka tsela e e farologaneng mo diseleng tsa T le mo dipalong tsa disele tsa tlhagala mo disampole tse di tshwanang tsa molwetse. Le fa mokgwa ono o na le melemo go feta go tlhopha disele tse di dirisiwang ke fluorescence, dilaeborari dingwe tsa metabolite di ka nna tsa amega ka ntlha ya go tlhomama ga tlholego le/kgotsa seelo sa thekiso e e bonako (22). Le fa go ntse jalo, mokgwa wa rona o ne wa kgona go supa di-metabolite tse pedi tse di amogelwang tse di thibelang masole a mmele, e leng adenosine le kynurenine, ka gonne di farologana thata fa gare ga mefuta ya disampole.
Tshekatsheko ya rona ya metabonomic ya ditlhagala le mefutapotlana ya TIL e naya dintlha tse dintsi ka ga seabe sa di-metabolites mo TME ya mae. Sa ntlha, re dirisa flow cytometry, re ne ra tlhomamisa gore ga go na pharologanyo mo tirong ya mitochondrial fa gare ga ditlhagala le disele tsa CD4 + T. Le fa go ntse jalo, tshekatsheko ya LC-MS/MS e ne ya senola diphetogo tse dikgolo mo bontsing jwa di-metabolite mo gare ga batho bano, se se supang gore diphetso ka ga metabolism ya TIL le tiro ya yone ya metaboliki ka kakaretso di tlhoka go tlhalosiwa ka kelotlhoko. Sa bobedi, MNA ke metabolite e e nang le pharologano e kgolo fa gare ga disele tsa CD45 le disele tsa T mo ascites, e seng ditlhagala. Ka jalo, go aroganngwa ga dikarolo le lefelo la tlhagala go ka nna le ditlamorago tse di farologaneng mo metabolism ya TIL, e e tlhagisang go sa tshwaneng go go ka nnang teng mo tikologong e nnye e e rileng. Sa boraro, polelo ya enzyme e e tlhagisang MNA ya NNMT e lekanyeditswe thata mo CAF, e leng disele tsa tlhagala ka selekanyo se sennye, mme maemo a MNA a a lemotshegang a lemogwa mo diseleng tsa T tse di tswang mo tlhagala. Go tlhagisiwa go feta selekanyo ga NNMT mo CAF ya mae go na le phelelo e e itsegeng ya go rotloetsa kankere, bontlhabongwe ka ntlha ya go rotloetsa metabolism ya CAF, go tlhasela ga tlhagala le go anama (27). Le fa selekanyo ka kakaretso sa TIL se le magareng, go tlhagisiwa ga NNMT mo CAF go amana thata le mofutapotlana wa mesenchymal wa Atlase ya Jenome ya Kankere (TCGA), e e amanang le go sa bone sentle (27, 46, 47). Kwa bofelong, go tlhagisiwa ga enzyme AOX1 e e ikarabelang ka go senyega ga MNA le gone go lekanyeditswe fela go batho ba CAF, se se supang gore disele tsa T ga di na bokgoni jwa go fetola MNA. Dipholo tseno di tshegetsa kgopolo ya gore le fa go tlhokega tiro e nngwe go tlhomamisa phitlhelelo eno, maemo a a kwa godimo a MNA mo diseleng tsa T a ka supa go nna teng ga tikologopotlana ya CAF e e thibelang masole a mmele.
Ka ntlha ya maemo a a kwa tlase a go tlhagisa dithoto tsa MNA le maemo a a sa lemotshegeng a diporoteine ​​tsa botlhokwa tse di amegang mo phetogong ya MNA, go nna teng ga MNA mo diseleng tsa T ga go a lebelelwa. Ga go na NNMT kgotsa AOX1 e e neng e ka lemogwa ka tshekatsheko ya scRNA-seq le qPCR e e lebisitsweng ya ditlhopha tse pedi tse di ikemetseng. Dipholo tseno di supa gore MNA ga e tlhakanngwe ke disele tsa T, mme e monyelwa go tswa mo TME e e di dikologileng. Diteko tsa in vitro di bontsha gore disele tsa T di na le go kokoanya MNA ya exogenous.
Dithuto tsa rona tsa vitro di bontshitse gore MNA ya exogenous e tlhotlheletsa go tlhagisiwa ga TNFα mo diseleng tsa T le go tokafatsa go tlama ga Sp1 le motlhotlheletsi wa TNFα. Le fa TNFα e na le ditiro tsa go lwantsha setlhagala le tsa go lwantsha setlhagala, mo kankereng ya mae, TNFα e ka rotloetsa kgolo ya kankere ya mae (31-33). The neutralization ya TNFα ka ovarian hlahala sele setso kapa ho fediswa ha TNFα pontšo ka dikai peba ka ntlafatsa TNFα-mediated ruruha cytokine tlhahiso le thibela hlahala kgolo (32, 35). Ka jalo, mo ntlheng eno, MNA e e tswang mo TME e ka dira jaaka metabolite e e thusang go ruruga ka mokgwa o o ikaegileng ka TNFα ka loop ya autocrine, ka jalo e rotloetsa go nna teng le go anama ga kankere ya mae (31). Go ikaegilwe ka kgonagalo eno, go ithutiwa ka thibelo ya TNFα jaaka sedirisiwa se se ka alafang kankere ya mae (37, 48, 49). Mo godimo ga moo, MNA e senya cytotoxicity ya disele tsa CAR-T mo diseleng tsa tlhagala ya mae, e naya bosupi jo bongwe gape jwa go gatelelwa ga masole a mmele a a tseregangwang ke MNA. Ka kakaretso, dipholo tseno di akantsha sekao se mo go sone ditlhagala le disele tsa CAF di ntshang MNA mo TME e e kwa ntle ga disele. Ka (i) tlhotlheletso ya kgolo ya kankere ya mae e e tlhotlhelediwang ke TNF le (ii) thibelo ya tiro ya cytotoxic ya disele tsa T e e tlhotlhelediwang ke MNA, seno se ka nna le phelelo e e gabedi ya tlhagala (Setshwantsho 5D).
Kwa bokhutlong, ka go dirisa motswako wa go humisa disele ka bonako, go latelana ga disele di le dingwe le go dira porofaele ya metaboliki, patlisiso eno e ne ya senola dipharologano tse dikgolo tsa immunometabolomic fa gare ga ditlhagala le disele tsa ascites mo balwetseng ba HGSC. Tshekatsheko eno e e tseneletseng e bontshitse gore go na le dipharologano mo go tseyeng sukiri le tiro ya mitochondrial fa gare ga disele tsa T, mme ya supa MNA jaaka metabolite e e sa ikemetseng ya masole a mmele e e laolang masole a mmele. Dintlha tseno di na le tlhotlheletso mo tseleng e TME e amang ka yone metabolism ya disele tsa T mo dikankereng tsa batho. Le fa go begilwe ka kgaisano e e tlhamaletseng ya dikotla fa gare ga disele tsa T le disele tsa kankere, di-metabolite le tsone di ka dira jaaka balaodi ba ba sa tlhamalalang go rotloetsa go tswelela pele ga tlhagala mme gongwe le go gatelela dikarabo tsa masole a mmele a a ka fa teng. Tlhaloso e nngwe ya karolo e sebetsang ya di-metabolites tsena tsa taolo e ka bula maano a mang a ho ntlafatsa karabelo ya masole a mmele a kgahlanong le sehlahala.
Disampole tsa molwetse le tshedimosetso ya kalafi di ne tsa bonwa ka polokelo ya dithishu tsa tlhagala ya kankere ya BC e e netefaditsweng ke Neteweke ya Polokelo ya Dithishu tsa Canada. Ho ya ka prothokholo e amohetsweng ke Komiti ya Maitsholo a Patlisiso ya Kankere ya BC le Yunivesithi ya British Columbia (H07-00463), disampole tsohle tsa bakudi le dintlha tsa tleliniki di fumane tumello e ngotsweng e nang le tsebo kapa di ile tsa tlohela tumello ya tsona semmuso. Disampole di bolokwa mo BioBank e e netefaditsweng (BRC-00290). Diponagalo tsa molwetse tse di tseneletseng di bontshiwa mo Mananeong S1 le S5. Go boloka tlhagala ya molwetse mo serame, go dirisiwa scalpel go bola ka motšhini sampole ya tlhagala ya molwetse mme morago ga moo e bo e kgoromeletsa mo setlhotlhing sa di-micron di le 100 go bona sele e le nngwe e e emisitsweng. Ascites ya molwetse e ne ya tlhotlhorega ka 1500 rpm metsotso e le 10 ka 4°C go dira disele tsa di-pellet le go tlosa se se neng se le mo godimo ga metsi. Disele tse di bonweng go tswa mo tlhatsaneng le mo di-ascites di ne tsa bolokwa mo serumong sa AB sa motho se se sa direng sepe ka mogote sa 50% (Sigma-Aldrich), 40% ya RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) le 10% ya dimethyl sulfoxide. Di-suspension tsena tse bolokilweng tsa sele e le nngwe di ile tsa qhibidiha mme tsa sebediswa bakeng sa metabolomics le ho etsa qeto ya metabolite e hlalositsweng ka tlase.
Sediriswa se se feletseng se na le 0.22 μm e e sefilweng 50:50 e e tlaleleditsweng RPMI 1640: AimV. RPMI 1640 + 2.05 mM l-glutamine (Saense ya Thermo Fisher) e e tlaleleditsweng ka 10% ya serum ya AB ya motho e e sa direng sepe ka ntlha ya mogote (Sigma-Aldrich), Hepes ya 12.5 mM (Saense ya Fisher ya Mogote), 2 mM ya l-glutamine (ya Saense ya Mogote) Tharabololo ya Streptomycin (PenStrep) le 50 μMB-mercaptoethanol. AimV (Invitrogen) e tlaleletswa ka Hepes ya 20 mM (Saense ya Batshwari ba Mogote) le l-glutamine ya 2 mM (Saense ya Batshwari ba Mogote). Sethibela-mabala sa phallo ya cytometer se ne se na le 0.22μm ya letswai le le tlhotlhilweng la phosphate (PBS; Invitrogen) le le tlaleleditsweng ka 3% ya serum ya motho ya AB e e sa direng sepe ka mogote (Sigma). Buffer ya go humisa disele e bopilwe ka PBS e e sefilweng ya 0.22μm mme e tlaleleditswe ka serum ya AB ya motho e e sa direng sepe ka mogote ya 0.5% (Sigma-Aldrich).
Mo sedirisiweng se se feletseng sa 37°C, disele di ne tsa tshasiwa ka 10 nM MT DR le 100 μM 2-NBDG metsotso e le 30. Morago ga moo, disele di ne tsa tshasiwa ka sefetolammala sa go kgona go tshela eF506 ka 4°C metsotso e le 15. Hlahisa disele hape ka FC Block (eBioscience) le Sethibela-Letheba se Bohlale (BD Biosciences), di fokotse ka sethibela-letheba sa phallo ya cytometer (ho ya ka ditaelo tsa moetsi), mme o di hlahise metsotso e 10 ka themphereitjha ya phaposi. Tshasa disele ka sete ya dilwantsha-ditwatsi (Lenaneo S2) mo sethibelong sa go tshasa sa flow cytometry ka 4°C metsotso e le 20. Resuspend disele mo sethibelong sa go tshasa sa phallo ya cytometry (Cytek Aurora; thulaganyo ya 3L-16V-14B-8R) pele ga tshekatsheko. Dirisa SpectroFlo le FlowJo V10 go sekaseka tshedimosetso ya palo ya disele, mme o dirise GraphPad Prism 8 go tlhama tshedimosetso. The bohareng fluorescence matla (MFI) ya 2-NBDG le MT DR e ne e le log-tlwaelehileng, 'me joale para t teko e ne e sebelisoa bakeng sa tlhahlobo ea dipalopalo ho ikarabella bakeng sa bakuli ba tshwanang. Tlosa dipalopalo tsotlhe tse di nang le ditiragalo tse di kwa tlase ga 40 mo tshekatshekong; tsenya boleng jwa MFI jwa 1 jwa boleng bongwe le bongwe jo bo sa siamang pele ga o dira tshekatsheko ya dipalopalo le pono ya tshedimosetso.
E le hore ho tlatsetsa pukwanana gating leano la ka holimo tshebetso phanele, re sebelisitse annotation feletseng ke sefate thibelo sebopeho (FAUST) (21) ho ka tsela e iketsang abela disele ho baahi ka mor'a ho fedisa disele tse shoeleng ka FlowJo. Re laola dipholo ka seatla go kopanya dipalopalo tse di lebegang di sa abelwe sentle (go kopanya PD1 + le disele tsa PD1-tumor) le dipalopalo tse di bolokilweng. Sampole nngwe le nngwe e na le palogare ya disele tse di fetang 2%, mo palogotlheng ya dipalopalo di le 11.
Ficoll gradient kitlano centrifugation e ne e sebediswa ho arola PBMC ho tloha dihlahiswa tsa karohano ya leukocyte (STEMCELL Technologies). Disele tsa CD8 + T di ne tsa kgaoganngwa go tswa mo PBMC go dirisiwa Di-MicroBeads tsa CD8 (Miltenyi) mme tsa atolosiwa mo sedirisiweng se se feletseng go dirisiwa TransAct (Miltenyi) dibeke di le 2 go ya ka ditaelo tsa motlhagisi. Disele di ne tsa letlelelwa go ema malatsi a le 5 mo sedirisiweng se se feletseng se se nang le IL-7 (10 ng/ml; PeproTech), mme morago ga moo tsa tlhotlhelediwa gape ka TransAct. Ka letsatsi la bo 7, go ya ka ditaelo tsa modiri, go ne ga dirisiwa di-CD45 MicroBeads tsa batho (Miltenyi) go humisa disele ka ditikologo di le tharo tse di latelana. Disele di ne tsa aroganngwa go sekasekwa ka cytometry ya phallo (jaaka go tlhalositswe fa godimo), mme disele di le milione o le mongwe di ne tsa aroganngwa makgetlo a le mararo go sekasekwa ka LC-MS/MS. Disampole di ne tsa dirisiwa ke LC-MS/MS jaaka go tlhalositswe fa tlase. Re fopholeditse boleng jwa metabolite jo bo tlhaelang ka palo ya ione ya 1 000. Sampole e nngwe le e nngwe e tlwaelehile ke palo yohle ya ion (TIC), e fetolwa ka logarithm mme e tlwaelehile ka ho iketsahalla ho MetaboAnalystR pele ho hlahloba.
The e le 'ngoe sele emisiwa ya mokuli e mong le e mong e ne e qhibidiha le sefa ka 40 μm sefe ho ba mahareng feletseng (jwalo ka ha ho hlalositsoe ka holimo). Ho ya ka prothokholo ya moetsi, ditikologo tse tharo tse latellanang tsa kgetho e ntle ka ho arola dipheta tsa makenete ho sebediswa MicroBeads (Miltenyi) di ile tsa sebediswa ho humisa disampole tsa disele tsa CD8+, CD4+ le CD45- (hodima aese). Ka bokhutshwane, disele di a tlhongwa gape mo sethibelang go humisa disele (jaaka go tlhalositswe fa godimo) mme di balwe. Disele di ne tsa tlhokomelwa ka dipheta tsa CD8 tsa batho, dipheta tsa CD4 tsa batho kgotsa dipheta tsa CD45 tsa batho (Miltenyi) ka 4°C metsotso e le 15, mme morago ga moo tsa tlhatswiwa ka buffer ya go humisa disele. Sampole e fetisiwa ka kholomo ya LS (Miltenyi), mme dikarolwana tse di siameng le tse di sa siamang di a kokoanngwa. Gore go fokodiwe nako le go oketsa kgato ya go boela mannong ga sele, morago ga moo go dirisiwa karolwana ya CD8 mo tikologong ya bobedi ya go humisa CD4+, mme karolwana ya CD4 e dirisiwa mo go humiseng CD45 go go latelang. Boloka tharabololo mo aese mo thulaganyong yotlhe ya go kgaoganya.
Go baakanyetsa disampole tsa tshekatsheko ya metabolite, disele di ne tsa tlhatswiwa gangwe ka tharabololo ya letswai e e tsididi jaaka aese, mme 1 ml ya 80% ya methanol e ne ya tsenngwa mo sampoleng nngwe le nngwe, morago ga moo ya vortexed le go gatsediwa ka bonako mo naeterojeneng e e metsi. Disampole di ne tsa tsenngwa mo dipopegong tse tharo tsa go gatsetsa-go thapologa mme tsa tsenngwa mo gare ga 14,000 rpm metsotso e le 15 ka 4°C. Se se fetang se se nang le di-metabolite se a mowafala go fitlha se oma. Dimetabolite di ne tsa tswalwa gape mo 50 μl ya 0.03% ya formic acid, tsa vortexed go tlhakanya, mme morago ga moo tsa tlhotlhorega go tlosa matlakala.
Ntsha di-metabolite jaaka go tlhalositswe fa godimo. Fetisetsa se se fetang mo lebotlolong la chromatography ya seedi sa tiragatso e e kwa godimo go dira dipatlisiso tsa metabolomics. Dirisa porothokholo ya kalafi e e sa rulaganngwang go alafa sampole nngwe le nngwe ka palo e e tshwanang ya disele go thibela ditlamorago tsa setlhopha. Re dirile tlhatlhobo ya boleng ya dimetabolite tsa lefatshe lotlhe tse di neng di gatisitswe mo nakong e e fetileng mo Sepekterometareng ya Bokete jwa Di-QTRAP 5500 tsa AB SCIEX QTRAP 5500 (50). Tshekatsheko ya chromatographic le go kopanngwa ga kgaolo ya tlhora go ne ga dirwa ka go dirisa sofotewere ya MultiQuant ya mofuta wa 2.1 (Dithulaganyo tsa Ditshedi tse di Dirisiwang SCIEX).
Palo ya ion ya 1000 e ne ya dirisiwa go fopholetsa boleng jwa metabolite jo bo tlhaelang, mme TIC ya sampole nngwe le nngwe e ne ya dirisiwa go bala lefelo le le tlwaelegileng la tlhora la metabolite nngwe le nngwe e e lemogilweng go baakanya diphetogo tse di tlhagisitsweng ke tshekatsheko ya didirisiwa go tswa mo tshebetsong ya sampole. Morago ga gore TIC e tlwaelege, MetaboAnalystR (51) (paramente ya ka gale) e dirisiwa go fetola logarithmic le go sekaseka mola o o tlwaelegileng ka go itirisa. Re sebedisitse PCA le vegan R sephuthelwana ho etsa tlhahlobo exploratory ya metabolome dipharologanyo pakeng tsa mefuta ya sampole, 'me re sebelisitse karolo redundancy tlhahlobo ho sekaseka bakuli. Dirisa mokgwa wa Ward go aga dendrogram ya mmapa wa mogote go kgobokanya sekgala sa Euclidean magareng ga disampole. Re sebedisitse limma (52) ka bongata bo lekanyeditsweng ba metabolite ho hlwaya di-metabolite tse ngata tse fapaneng ho pholletsa le mofuta ohle wa sele le tikoloho e nyane. Gore re nolofatse tlhaloso, re dirisa paramente ya palogare ya setlhopha go totobatsa sekao, le go akanyetsa mefuta ya disele mo tikologong e nnye jaaka setlhopha sengwe le sengwe (n = ditlhopha di le 6); bakeng sa teko ya bohlokwa, re ile ra etsa ditekanyetso tse tharo tse pheta-phetwang bakeng sa metabolite e nngwe le e nngwe E le hore re qobe ho pheta-pheta ho fosahetseng, mokudi o ile a kenyeletswa e le sekgoreletsi moralong wa limma. Gore re kgone go tlhola dipharologano tsa di-metabolite fa gare ga balwetse ba ba farologaneng, re ne ra fetola sekao sa limma go akaretsa le balwetse ka tsela e e tlhomameng. Re bega botlhokwa jwa pharologano e e tlhalositsweng pele ga nako fa gare ga mofuta wa sele le tikologo e nnye ya Padj <0.05 (tokiso ya Benjamini-Hochberg).
Morago ga go humisa maatla ka go dirisa Miltenyi Dead Cell Removal Kit (> 80% ya go kgona), go ne ga dirwa tatelano ya transcriptome ya sele e le nngwe mo disampole tsotlhe tsa ascites tse di gatseditsweng tse di tshelang le tsa tlhagala go dirisiwa porothokholo ya go tlhagisa dijini tsa 10x 5′. Dikgetse di le tlhano tse di nang le ditlhagala tse di tshwanang le ascites di ne tsa sekasekwa, le fa go kgona go tshela go go kwa tlase go tswa mo sampoleng e le nngwe ya tlhagala go ne ga thibela go akarediwa ga yone. Gore re kgone go fitlhelela ditlhopho tse dintsi tsa balwetse, re ne ra kopanya disampole tsa molwetse mongwe le mongwe mo meleng ya molaodi wa chromium wa 10x, mme ra sekaseka mafelo a ascites le a tlhagala ka go kgaogana. Morago ga go latelana [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp e e kopantsweng (PE), jenome ya Quebec; palogare ya 73,488 le 41,378 e e balwang ke sele nngwe le nngwe ya tlhagala le ascites ka go latelana]], re dirisitse CellSNP le Vireo (53) (e e theilweng mo CellSNP jaaka SNP e e tlwaelegileng ya motho (VCF) e e tlamelwang ke GRCh38 e abetswe boitshupo jwa genotype (boemo jwa molwetse wa close's go (IBS), ntle le disele tse sa abelwang le disele tse supilweng e le duplexes le bafani ba tshwanang pakeng tsa ascites le disampole tsa hlahala (54 Motheong wa mosebetsi ona, re ile ra boloka dinyewe tse tharo tse nang le boemedi bo bongata ba disele ka hlahala le ascites bakeng sa tlhahlobo e tlase (scCo 5). e hlahisitse disele tse 6975 (disele tse 2792 le tse 4183 ho tswa ho tlhagala le ascites, ka ho latellana) bakeng sa tlhahlobo Re sebedisa igraph ya (57) Louvain ho kopanya dijini tse arolelanwang tsa marangrang a haufi ka ho fetisisa (SNN) tse thehilweng hodima sekgala sa Jaccard ho disele tsa sehlopha ka ho hlahisa disele tse thehilweng hodima seatla. le bonwa le t-SNE disele tsa T di hlalositswe ke polelo ya CD8A le GZMA, ho sa kenyeletswe dihlopha tse nyane tse nang le polelo e tlase ya protheine ya Izar et al (16), ho kenyeletswa le ho kenngwa ha bona ha t-SNE, ka laola polelo ea marNNMTs.
PBMC di ne di kgaogantswe le ditlhagiswa tsa go kgaoganya disele tsa madi (STEMCELL Technologies) ka go tlhotlhora ga kitlano ya Ficoll. Disele tsa CD3 + di ne tsa kgaoganngwa go tswa mo PBMC go dirisiwa dipheta tsa CD3 (Miltenyi). Fa MNA e le teng kgotsa e seyo, disele tsa CD3+ di ne tsa tsenngwa tirisong ka CD3 e e bofilweng mo dipoleiting (5μg/ml), CD28 e e tlhotlhoregang (3μg/ml) le IL-2 (300 U/ml; Proleukin). Ka letsatsi la bofelo la katoloso, go kgona go dira (De e e Kgona e e Tlhomamisiwang eFluor450, eBioscience) le go ata (di-eBeads di le 123count, Thermo Fisher Scientific) di ne tsa sekasekwa ka go dirisa cytometry ya kelelo. Sekaseka tiro ya sediriswa se se dirang ka go tlhotlheletsa disele ka PMA (20 ng/ml) le ionomycin (1μg/ml) ka GolgiStop diura di le 4, mme o tlhokomele CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4) , BioLegend) le TNFore-PerCP (MAb11, Bd). Tlhotlheletsa disele tsa qPCR le ChIP ka PMA (20 ng / ml) le ionomycin (1 μg / ml) diura di le 4. Setlhare sa ELISA se ne sa kokoanngwa pele le morago ga go tlhotlhelediwa ka PMA (20 ng/ml) le ionomycin (1 μg/ml) diura di le 4.
Latela porothokholo ya modiri go kgaoganya RNA o dirisa RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN). Dirisa Sediriswa sa go Tlhaola sa QIA (QIAGEN) go dira gore sampole e nne e e tshwanang. Dirisa sediriswa sa RNA go ya go cDNA sa bokgoni jo bo kwa godimo (Saense ya Thermo Fisher) go tlhama DNA e e tlaleletsang (cDNA). Dirisa Motswako wa Motheo wa TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) go lekanya tlhagiso ya dijini (go ya ka porothokholo ya modiri) ka dipatlisiso tse di latelang: Hs02786624_g1 [gliseraldehaete-3-fosefeite go tswa mo Haeterojeneng (GAPDH)] le Hs01010726_m1 (SLC22A2). Disampole di ne di dirisiwa mo thulaganyong ya PCR ya nako ya nnete ya StepOnePlus (Dithulaganyo tsa Ditshedi tse di Dirisiwang) (Dithulaganyo tsa Ditshedi tse di Dirisiwang) mo poleiting ya tsibogo ya didiba di le 96 e e bonako ya MicroAmp (Dithulaganyo tsa Ditshedi tse di Dirisiwang) e e nang le filimi ya MicroAmp ya matlho. Boleng bongwe le bongwe jwa Ct jo bo fetang 35 bo tsewa bo le kwa godimo ga selekanyo sa go lemogwa mme bo tshwailwe jaaka jo bo sa lemogegeng.
Dira ChIP jaaka go tlhalositswe pelenyana (58). Ka bokhutshwane, disele di ne tsa alafiwa ka formaldehyde (botlhofo jwa bofelo jwa 1.42%) mme tsa tlhokomelwa mo themphereitšheng ya phaposi metsotso e le 10. Dirisa sethibela-go ruruga se se tlaleleditsweng (25 mM Hepes, 1.5 mM MgCl2, 10 mM KCl le 0.1% NP-40) mo aese metsotso e le 10, morago ga moo o bo o se tlhoma gape mo sethibelang-go ruruga ga mmele jaaka go tlhalositswe (58 ). Sampole e ne ya sonicated ka dipotologo tse di latelang: dipotologo di le 10 (di-pulse di le 20 tsa motsotswana o le 1) le nako e e sa fetogeng ya metsotswana e le 40. Dilwantsha-ditwatsi tsa immunoglobulin G (Thekenoloji ya go Bontsha Disele; 1μl), histone H3 (Thekenoloji ya go Bontsha Disele; 3μl), NFAT (Invitrogen; 3μl) le SP1 (Thekenoloji ya go Bontsha Disele; 3μl) ka bokete jo bo kwa godimo ga CC°4 jwa sampole. Hudisa dipheta tsa poroteine ​​A (Thermo Fisher Scientific) le sampole ka 4°C ka go tshikinya ka bonolo sebaka sa ura e le 1, morago ga moo dirisa dipheta tsa chelex (Bio-Rad) go humisa DNA, mme o dirise poroteine ​​K (Thermo Fisher) go sila dijo tsa poroteine. TNFα motlhotlheletsi o ne a lemogiwa ka PCR: kwa pele, GGG TAT CCT TGA TGC TGT; go na le moo, GTG CCA ACA MOLAO GCC TTT ATA TG (setlhagiswa sa 207-bp). Ditshwantsho di ne tsa tlhagisiwa ke Image Lab (Bio-Rad) mme tsa lekanngwa go dirisiwa serweboleta sa ImageJ.
Supernatant ya setso sa sele e ne ya kokoanngwa jaaka go tlhalositswe fa godimo. Boikemisetso bo ile ba etswa ho latela mekgwatshebetso ya moetsi ya sesebediswa sa ELISA sa TNFα sa motho (Invitrogen), sesebediswa sa ELISA sa IL-2 sa motho (Invitrogen) le sesebediswa sa ELISA sa IFN-γ sa motho (Abcam). Go ya ka porothokholo ya modiri, supernatant e ne ya tlhaolosiwa ka 1:100 go lemoga TNFα le IL-2, le 1:3 go lemoga IFN-γ. Dirisa Sebadi sa Dileibole tse dintsi sa EnVision 2104 (PerkinElmer) go lekanya monyelo kwa 450 nm.
PBMC di ne di kgaogantswe le ditlhagiswa tsa go kgaoganya disele tsa madi (STEMCELL Technologies) ka go tlhotlhora ga kitlano ya Ficoll. Disele tsa CD3 + di ne tsa kgaoganngwa go tswa mo PBMC go dirisiwa dipheta tsa CD3 (Miltenyi). Fa MNA e le teng kgotsa e seyo, disele tsa CD3+ di ne tsa dirisiwa ka CD3 e e bofilweng mo dipoleiting (5μg/ml), CD28 e e tlhotlhoregang (3μg/ml) le IL-2 (300 U/ml; Proleukin) malatsi a le 3. Morago ga malatsi a le 3, disele di ne tsa kokoanngwa le go tlhatswiwa ka 0.9% ya letswai, mme pellet e ne ya gatsediwa ka bonako. Palo ya disele e ne ya dirwa ka go elela ga disele (Cytek Aurora; thulaganyo ya 3L-16V-14B-8R) go dirisiwa di-eBead tsa palo ya 123.
Ntsha di-metabolite jaaka go tlhalositswe fa godimo. Setlhotlhi se se omisitsweng se ne sa bopiwa sešwa ka kgobokano ya disele tsa 4000 tse di lekanang/μl. Sekaseka sampole ka go dirisa mmala wa legato le le buseditsweng morago (1290 Infinity II, Dithekenoloji tsa Agilent, Santa Clara, CA) le kholomo ya CORTECS T3 (2.1×150 mm, bogolo jwa dikarolwana 1.6-μm, bogolo jwa marose 120-Å; #186008500). Sepekterometara sa bokete jwa polara (6470, Agilent), se mo go sone go gasa ga motlakase go dirang ka mokgwa o o siameng. Kgato ya A e e tsamayang ke 0.1% ya esiti ya formiki (mo H2O), kgato ya B e e tsamayang ke 90% ya asetonitrile, 0.1% ya esiti ya formiki. Mothalo wa LC ke metsotso e le 0 go ya go e le 2 mo go 100% A, metsotso e le 2 go ya go e le 7.1 mo go 99% B, le metsotso e le 7.1 go ya go e le 8 mo go 99% B. Go tswa foo lekalekanya gape kholomo le legato le le tsamayang A ka seelo sa kelelo sa 0.6 ml/motsotso mo metsotsong e le 3. . Seelo sa kelelo ke 0.4ml/motsotso, mme phaposi ya kholomo e gotediwa go fitlha go 50°C. Dirisa seelo se se phepa sa khemikhale sa MNA (M320995, Khamphani ya Dikhemikhale ya Patlisiso ya Toronto, North York, Ontario, Canada) go tlhomamisa nako ya go boloka (RT) le phetogo (RT = metsotso e le 0.882, phetogo 1 = 137→94.1, phetogo 2 = 137→94.1, phetogo 2 = 137→1293). Fa diphetogo tsotlhe tse tharo di diragala ka nako e e siameng ya go boloka, phetogo 1 e dirisiwa go dira tekanyetso go netefatsa go tlhomama. Sebopego se se tlwaelegileng sa MNA (Khamphani ya Dikhemikhale ya Patlisiso ya Toronto) se ne sa tlhagisiwa ke ditlhaoloso di le thataro tsa tatelano tsa tharabololo ya setoko (1 mg/ml) go bona maemo a 0.1, 1.0, 10 le 100 ng/ml le 1.0 le 10μg/ml ka go latelana seedi. Moedi wa ho lemoha ke 1 ng/ml, mme karabelo ya mola e pakeng tsa 10 ng/ml le 10μg/ml. E mong le e ente ya microliters tse peli tsa sampole le boemo e sebediswa bakeng sa LC / MS tshekatsheko, 'me e tsoakiloeng boleng taolo sampole e matha mong le e mong tse robeli ente ho netefatsa botsitso ba tshekatsheko sethaleng. Dikarabo tsa MNA tsa disampole tsotlhe tsa disele tse di alafilweng ka MNA di ne di le mo teng ga selekanyo sa mola sa teko. Tshekatsheko ya tshedimosetso e dirilwe ka go dirisa sofotewere ya tshekatsheko ya bontsi ya MassHunter (v9.0, Agilent).
Moloko wa bobedi wa αFR-CAR o ne o tserwe go tswa go Song et al. (59). Ka bokhutshwane, kago e na le diteng tse di latelang: tatelano ya moeteledipele wa CD8a, karolwana e e fetogang ya ketane e le nngwe e e kgethegileng ya αFR ya motho, sekgomaretsi sa CD8a le kgaolo ya transmembrane, karolo ya CD27 ya mo teng ga disele le karolo ya CD3z ya mo teng ga disele. Tatelano e e feletseng ya CAR e ne ya kopanngwa ke GenScript, mme morago ga moo ya kopisiwa mo vector ya tlhagiso ya lentiviral ya kokomana ya bobedi e e kwa godimo ga khasete ya tlhagiso ya GFP e e dirisiwang go sekaseka bokgoni jwa phetolelo.
Lentivirus e tlhagisiwa ka go fetisiwa ga disele tsa HEK293T [Pokello ya Setso sa Mofuta wa Amerika (ATCC); e godisitswe mo sedirisiweng sa Dulbecco se se fetotsweng sa Eagle se se nang le 10% ya serum ya kgomo ya lesea le le mo popelong (FBS) le 1% ya PenStrep, mme e dirisitse vector ya CAR-GFP le Dipolasemiti tsa go phuthela (psPAX2 le pMD2.G, Addgene) di dirisa amine ya go tlhokomela mafura (Sigma-Aldrich). Supernatant e e nang le mogare e ne ya kokoanngwa diura di le 48 le 72 morago ga go fetisiwa, ya sefiwa, le go tsepamisiwa ka ultracentrifugation. Boloka supernatant ya vaerase e e tseneletseng kwa -80°C go fitlha e fetolwa.
PBMC di kgaogantswe le ditlhagiswa tsa go kgaoganya disele tsa madi tsa moneelo tse di itekanetseng (STEMCELL Technologies) ka go tlhotlhora kitlano ya Ficoll. Dirisa dipheta tse dinnye tsa CD8 tsa tlhopho e e siameng (Miltenyi) go kgaoganya disele tsa CD8+ go tswa mo PBMC. Tlhotlheletsa disele tsa T ka TransAct (Miltenyi) le mo sedirisiweng sa TexMACS [Miltenyi; e tlaleleditswe ka 3% ya serum ya motho e e sa direng sepe ka mogote, 1% ya PenStrep le IL-2 (300 U/ml)]. Diura di le masome a mabedi le bone morago ga go tlhotlhelediwa, disele tsa T di ne tsa fetolelwa ka lentivirus (10 μl ya supernatant ya mogare e e tseneletseng mo diseleng di le 106). Malatsi a le 1 go ya go a le 3 morago ga phetolelo mo Cytek Aurora (mo FSC (Go Phasalatsa kwa Pele)/SSC (Go Phasalatsa kwa Letlhakoreng), Singlet, GFP+), sekaseka tlhagiso ya GFP ya disele go bontsha bokgoni jwa phetolelo jwa bonnye 30% .
Disele tsa CAR-T di ne tsa tlholwa diura di le 24 mo Immunocult (Dithekenoloji tsa STEM; di tlaleleditswe ka 1% ya PenStrep) mo maemong a a latelang: di sa alafiwa, di alafilwe ka 250 μM adenosine kgotsa 10 mM MNA. Morago ga go alafiwa pele, disele tsa CAR-T di ne tsa tlhatswiwa ka PBS mme tsa kopanngwa le disele di le 20 000 tsa SK-OV-3 [ATCC; mo sedirisiweng sa McCoy 5A (Sigma-Aldrich) se se tlaleleditsweng ka 10% FBS le 1% PenStrep ka 10: Tekanyo ya sediriswa go ya go se se ikaeletsweng ya 1 e ne ya godisiwa ka makgetlo a le mararo mo sedirisiweng sa Immunocult se se tlaleleditsweng. Disele tsa SK-OV-3 le disele tsa SK-OV-3 tse di lysed ka saponin ya digitalis (0.5mg / ml; Sigma-Aldrich) di ne tsa dirisiwa jaaka ditaolo tse di sa siamang le tse di siameng, ka go latelana. Morago ga diura di le 24 tsa go lema mmogo, metsi a a kwa godimo a ne a kokoanngwa mme lactate dehydrogenase (LDH) e ne ya lekanngwa go ya ka ditaelo tsa modiri (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega). Se se fetang sa LDH se ne sa tlhaolosiwa ka 1:50 mo sethibelong sa LDH. Peresente ya polao e ne e lekanngwa ka go dirisa fomula e e latelang: phesente ya polao = phesente ya paakanyo / seelo se se kwa godimo sa polao x 100%, fa phesente ya paakanyo = disele tsa co-culture-T fela, le seelo se se kwa godimo sa polao = taolo e e siameng-taolo e e sa siamang.
Jaaka go tlhalositswe mo setlhangweng kgotsa mo didirisiweng le mekgwa, dirisa GraphPad Prism 8, Microsoft Excel kgotsa R v3.6.0 go dira tshekatsheko ya dipalopalo. Fa disampole tse dintsi di kokoanngwa go tswa mo molwetseng a le mongwe (jaaka ascites le tlhagala), re dirisa teko ya t e e kopantsweng kgotsa re akaretsa molwetse jaaka phelelo e e sa rulaganngwang mo sekaong sa mola kgotsa se se akaretsang jaaka go tshwanetse. Bakeng sa tlhahlobo ya metabolomics, teko ya bohlokwa e etswa ka makgetlo a mararo.
Go bona didirisiwa tsa tlaleletso tsa setlhogo seno, tsweetswee leba http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1.
Seno ke setlhogo se se bulegileng se se anamisiwang ka fa tlase ga melawana ya Laesense ya Creative Commons Attribution-Non-Commercial, e e letlang tiriso, go anamisiwa le go gatisiwa gape ka sedirisiwa sepe fela, fa fela tiriso ya bofelo e se ya go bona dipoelo tsa kgwebo mme ntlha e le gore tiro ya ntlha e nepagetse. Tshupetso.
Ela tlhoko: Re go kopa fela gore o neele aterese ya gago ya imeile gore motho yo o mo akantshang mo tsebeng a itse gore o batla gore a bone imeile le gore ga se sepamo. Ga re na go tsaya diaterese dipe tsa imeile.
Potso eno e dirisiwa go leka gore a o moeng le go thibela thomelo ya sepamo ka go itirisa.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sara MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. (Rusele G. Jones), Phinease T. Hamilton (Finease T.
MNA e na le seabe mo go gateleleleng masole a mmele a disele tsa T mme e emela sepheo se se ka nnang teng sa kalafi ya masole a mmele sa kalafi ya kankere ya batho.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sara MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. (Rusele G. Jones), Phinease T. Hamilton (Finease T.
MNA e na le seabe mo go gateleleleng masole a mmele a disele tsa T mme e emela sepheo se se ka nnang teng sa kalafi ya masole a mmele sa kalafi ya kankere ya batho.
©2021 Mokgatlho wa Amerika wa Kgatelopele ya Saense. ditshwanelo tsotlhe di beilwe. AAAS ke molekane wa HINARI, AGORA, OARE, KHORASE, CLOCKSS, CrossRef le COUNTER. Dikgatelopele tsa Saense ISSN 2375-2548.